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      Sanger測序常見問題


      收費標準

      A:
      判讀結果 是否收費
      彌散 不收費
      氣泡 不收費
      光譜拉高 不收費
      衰減 不收費
      無信號 不收費
      成功 收費
      套峰 收費
      中斷 收費*
      ITR測序 收費*

      *安升達會為您安排部分樣品進行特殊方案重測。如果您希望剩余樣品也進行重測,請直接回復郵件。
      *ITR樣品測序均收費(100元/反應,含一次免費重測)。
      說明:針對判讀結果為“中斷”的訂單,并非所有復雜結構都適用特殊方案并測序成功,所以您要求的重測反應成功與否都將收費。
      由于樣品自身原因造成的測序失?。o信號、衰減等),經驗證或溝通確認,均將放行并收費。

      客戶賬號
      A:
      在公司網站主頁(www.tagbusinesscoaching.com)的右上角,點擊“注冊”,就可以注冊新賬號,請填寫您的登錄名(您的E-mail地址)和密碼。這個過程僅需要幾分鐘的時間,然后您會收到賬號激活的郵件,點擊其中的鏈接即可,激活后可以馬上使用。準備提交您在安升達的第一個訂單吧!
      A:
      歡迎使用安升達的服務!我們會提供給新客戶一份安升達新客戶體驗券來免費試用我們的Sanger測序服務。需要您做的就是發送郵件至Support.Asia@Azenta.com 或撥打安升達的免費服務電話400-8100-669選項1,以了解更多的服務信息。
      A:
      當然可以!我們歡迎全世界的顧客。在建立賬號的過程中,會被要求填寫所在城市,如果您身處國外,請在下拉菜單中選擇“其它”,并請提供正確的城市和郵編。所有其它的地區請按實情填寫。
      A:
      安升達始終遵循“以客戶為導向”的經營理念。我們已經成為Sanger測序和包括基因合成在內的分子生物學服務的領軍者之一,能夠為客戶提供最佳價值組合:快速提交結果、專業的技術服務、具有競爭力的價格以及細致周到的客戶服務。 歡迎您選擇安升達!

      Sanger常規測序樣品的制備

      A:
      常規測序服務是指針對各種類型DNA模板的測序??蛻舴謩e提交測序模板和引物(或者使用安升達的通用引物),由安升達測定樣品的濃度,確定測序反應的使用量,然后進行的測序。
      A:

      絕大多數的測序反應結果都沒有問題,但是注意以下幾點可以盡量避免產生不理想的測序結果。 以下是我們的樣品準備指南,以幫助您優化測序結果:

      1)盡量遵循Sanger測序樣品制備指南的要求制備樣品。DNA模板和測序引物的質量是影響測序結果的主要因素。

      2)確保您的引物與模板完全匹配。引物與模板不完全匹配可能導致測序結果不佳。測序引物長度應在18-24bp之間,退火溫度56-60℃,GC含量45-55%。

      3)避免污染物的污染。鹽、EDTA、酒精、蛋白、RNA、洗滌劑、銫和苯酚是最常見的污染物,會造成測序結果不佳或測序失敗。

      4)請確保選擇正確的測序服務類型。對于某些特殊的模板(如含發卡結構或富含GC的模板),為了得到好的測序結果,請在測序訂單中注明其“序列特點”。

      A:
      我們保證一個成功的測序反應的有效讀長是800bp。如果您的目的片段大于800bp,您可以選擇測通,我們會根據您的插入片段長度設計引物進行加測。
      A:
      質粒、PCR產物(PCR已純化或者單一條帶的PCR原液)、細菌(菌落或甘油菌)、環狀基因組的噬菌體(噬菌體上清液或噬菌斑)都可以進行。 “預混合服務”只針對質粒和已純化PCR。
      A:
      登錄您的安升達賬戶,點擊賬戶信息下的郵件配置,選擇您想要接收的郵件。
      A:
      對于測序要求為測通的訂單我們會為您直接拼接的,如無法拼接會為您設計引物加測直至可以拼接;您也可以在訂單備注“需拼接”或電話,郵件與我們聯系要求拼接結果。
      A:
      請盡量遵循Sanger測序樣品制備指南的要求準備樣品。
      A:
      建議您使用分光光度計,如NanoDrop,檢測260/280和260/230的比值來檢測樣品的濃度。也可以利用一小部分DNA樣品通過瓊脂糖電泳,并利用已知濃度的marker作為參照,進而確定DNA模板的濃度。
      A:
      長度小于200bp的樣品不適合測序驗證,建議將片段克隆后再用質粒進行測序。
      A:
      可以!安升達有針對復雜結構的測序方案,能夠成功地對富含GC的和含復雜二級結構如發卡結構的模板進行測序。在提交訂單時,請在“序列特點”選擇樣品的序列特點。
      A:
      除特殊情況外,模板和引物的保存時間是1個月。由于菌液和平板菌落很容易老化,我們的保存時間是半個月。如果您的DNA樣品和引物還要用于后續訂單,請將此注明在訂單的“備注”部分。 我們不建議您使用保存時間過長的樣品進行測序。如果您需要加測,建議您重新送樣品和引物。 建議您每次在送樣時對樣品備份。如果多次測序使用完了您送的樣品,我們一般不負責重新制備。
      A:
      請將您的PCR模板和引物分開存放,并貼好標簽。建議提供一張模板的凝膠照片,并注明上樣量。在提交訂單時,請在服務類型中選擇“需切膠PCR原液”,我們會根據您的凝膠照片對PCR產物進行純化并優化測序結果。
      A:
      您可以任何品牌的PCR板和蓋子。請保證你的樣品在96孔板中是成列或垂直方向排列即可。
      A:
      我們建議您在送樣前保留一份樣品的備份,防止樣品在郵寄過程中丟失等不可抗拒的因素影響。
      A:
      為了積極響應政府疫情防控號召,即日起,我司暫停進行與新冠病毒N基因和ORF1a/1b(全序列或部分序列)相關的測序服務。
      Sanger測序結果
      A:
      在測序儀中,每個含熒光標記末端的片段,經毛細管電泳至指定位置時會釋放出熒光信號,該信號被CCD圖像傳感器捕獲。記錄下熒光信號的峰值被最終整理生成軌跡數據文件(即序列圖譜,*.ab1文件)。不同的堿基使用不同顏色的熒光標記,使用序列分析程序即可根據這些峰值判斷出對應的堿基。
      A:
      堿基的質量值(Quality Value)用于量化評估該堿基的可信度,由序列分析程序根據該堿基的峰形計算得出(QV = -10log10Pe;Pe—Probability of Error, 誤差率)。QV越高,誤差率越低。QV與Pe的對應關系為: 質量值(QV) 誤差率(Pe) 1~10 79%- 10% 11-20 7.9%-1.0% 21-30 0.79%-0.10% 31-40 0.079%-0.010% 50及以上 0.001%及以下
      A:
      測序結果的序列質量得分(Quality Score, QS)是序列中所有堿基質量值(Quality Value)的平均值,用于判斷測序結果整體的可信度。 關于有效讀長,安升達選用的標準為序列連續讀長(Contiguous Read Length,CRL)。即整個序列中,各個堿基質量值均大于20(可信度大于99%)的片段里,最長片段的長度。
      A:

      測序結果無任何明顯干擾,前800bp連續可讀。通常菌液或質粒樣品,一個測序反應讀長可達1000bp,由于Sanger測序的局限性前50bp可能存在誤差;PCR產物測序常以終止信號A尾結束。

      點擊查看峰圖實例。

      引物相關問題

      A:
      建議您在目標序列上游100bp處設計測序引物。如果沒有緩沖區域,就在序列上游的50-60堿基處設計引物。但是與目標序列越靠近,就越容易錯過部分目標序列。引物的長度應為18-24bp,退火溫度為56-60℃,GC含量為45-55%。您也可以利用引物設計軟件來設計引物,主要影響因素包括引物的Tm值、GC含量和二聚體。
      A:
      可以。如果您知道引物的序列,僅需要在測序訂單中注明即可。如果您需要安升達為您設計引物,請在訂單中注明目標序列中的相關信息發郵件至Support.Asia@Azenta.com。
      A:
      請點擊查看安升達提供的通用引物。
      您可以使用同一頁面中的安升達通用引物選擇工具,查詢測序所需的引物。

      擴增測序相關問題

      疑難解答

      A:
      如果首次未擴增出片段或濃度無法達到測序要求,我們默認會根據實際情況調整方案重新擴增,若兩次均擴增失敗則更新為重新擴增失敗的狀態。
      A:
      擴增后得到的片段有時會存在非特異性條帶,需要進行切膠純化。樣本在回收過程中就會出現一定的損耗,導致得到的已純化PCR產物濃度無法達到測序要求。
      A:
      我們可以免費為您解決測序過程中遇到的各種難題。如果測序失敗,我們會發送給您一份說明文件,標注出失敗原因,您也可以聯系我們的技術支持 ,或者發送郵件至Support.Asia@Azenta.com來尋求幫助。
      A:
      針對無信號、高背景和衰減三種失敗類型,我們將按照一定的比例安排重測,若重測結果成功,則將與其失敗原因相同的其他樣品按照同樣的方法安排重測。您可以聯系我們的技術支持 ,或者發送郵件至Support.Asia@Azenta.com來尋求幫助。
      A:
      當聚合酶遇到序列中的polyA或polyT時,往往會發生移滑,進而導致測序結果的非特異性或不理想。每當出現這種情況時,我們就會建議進行反向測序,以得到缺失的序列數據。
      A:
      引物越長,Tm值就越高,測序反應過程中的DNA模板就越不容易退火,可能就會產生不理想的結果。我們建議您使用安升達通用引物或者您自己設計的引物長度要在18-24bp之間,退火溫度為56-60℃,GC含量為45-55%。
      A:
      最有可能的原因是引物降解,另一個原因可能是您的PCR引物雖然適合于PCR反應,但是不適合用于測序反應。我們建議您的測序引物長度在18-24bp之間,退火溫度56-60℃,GC含量為45-55%。PCR引物越長,測序結果可能越不理想。而且,并不是所有的PCR引物都適合被用做測序引物。如果您的PCR引物對測序結果不利,我們建議您設計巢式引物來作為測序引物。
      A:

      Sanger測序常見的失敗類型如下,請點擊鏈接查看具體的原因及解決辦法。

      Poly結構或重復序列

      高背景

      光譜拉高

      彌散

      氣泡

      衰減

      套峰

      無信號

      引物問題

      中斷

       
      A:
      由于樣品的保存期為1個月,因此有效投訴期為1個月之內,1個月后視為無效投訴,不予處理。
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