Sanger測序常見問題

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歡迎使用安升達的服務！我們會提供給新客戶一份安升達新客戶體驗券來免費試用我們的Sanger測序服務。需要您做的就是發送郵件至Support.Asia@Azenta.com 或撥打安升達的免費服務電話400-8100-669選項1，以了解更多的服務信息。

當然可以！我們歡迎全世界的顧客。在建立賬號的過程中，會被要求填寫所在城市，如果您身處國外，請在下拉菜單中選擇“其它”，并請提供正確的城市和郵編。所有其它的地區請按實情填寫。

安升達始終遵循“以客戶為導向”的經營理念。我們已經成為Sanger測序和包括基因合成在內的分子生物學服務的領軍者之一，能夠為客戶提供最佳價值組合：快速提交結果、專業的技術服務、具有競爭力的價格以及細致周到的客戶服務。 歡迎您選擇安升達！

常規測序服務是指針對各種類型DNA模板的測序?？蛻舴謩e提交測序模板和引物（或者使用安升達的通用引物），由安升達測定樣品的濃度，確定測序反應的使用量，然后進行的測序。

絕大多數的測序反應結果都沒有問題，但是注意以下幾點可以盡量避免產生不理想的測序結果。 以下是我們的樣品準備指南，以幫助您優化測序結果：

1）盡量遵循Sanger測序樣品制備指南的要求制備樣品。DNA模板和測序引物的質量是影響測序結果的主要因素。

2）確保您的引物與模板完全匹配。引物與模板不完全匹配可能導致測序結果不佳。測序引物長度應在18-24bp之間，退火溫度56-60℃，GC含量45-55%。

3）避免污染物的污染。鹽、EDTA、酒精、蛋白、RNA、洗滌劑、銫和苯酚是最常見的污染物，會造成測序結果不佳或測序失敗。

4）請確保選擇正確的測序服務類型。對于某些特殊的模板（如含發卡結構或富含GC的模板），為了得到好的測序結果，請在測序訂單中注明其“序列特點”。

我們保證一個成功的測序反應的有效讀長是800bp。如果您的目的片段大于800bp，您可以選擇測通，我們會根據您的插入片段長度設計引物進行加測。

質粒、PCR產物（PCR已純化或者單一條帶的PCR原液）、細菌（菌落或甘油菌）、環狀基因組的噬菌體（噬菌體上清液或噬菌斑）都可以進行。 “預混合服務”只針對質粒和已純化PCR。

登錄您的安升達賬戶，點擊賬戶信息下的郵件配置，選擇您想要接收的郵件。

對于測序要求為測通的訂單我們會為您直接拼接的，如無法拼接會為您設計引物加測直至可以拼接；您也可以在訂單備注“需拼接”或電話，郵件與我們聯系要求拼接結果。

請盡量遵循Sanger測序樣品制備指南的要求準備樣品。

建議您使用分光光度計，如NanoDrop,檢測260/280和260/230的比值來檢測樣品的濃度。也可以利用一小部分DNA樣品通過瓊脂糖電泳，并利用已知濃度的marker作為參照，進而確定DNA模板的濃度。

長度小于200bp的樣品不適合測序驗證，建議將片段克隆后再用質粒進行測序。

可以！安升達有針對復雜結構的測序方案，能夠成功地對富含GC的和含復雜二級結構如發卡結構的模板進行測序。在提交訂單時，請在“序列特點”選擇樣品的序列特點。

除特殊情況外，模板和引物的保存時間是1個月。由于菌液和平板菌落很容易老化，我們的保存時間是半個月。如果您的DNA樣品和引物還要用于后續訂單，請將此注明在訂單的“備注”部分。 我們不建議您使用保存時間過長的樣品進行測序。如果您需要加測，建議您重新送樣品和引物。 建議您每次在送樣時對樣品備份。如果多次測序使用完了您送的樣品，我們一般不負責重新制備。

請將您的PCR模板和引物分開存放，并貼好標簽。建議提供一張模板的凝膠照片，并注明上樣量。在提交訂單時，請在服務類型中選擇“需切膠PCR原液”，我們會根據您的凝膠照片對PCR產物進行純化并優化測序結果。

您可以任何品牌的PCR板和蓋子。請保證你的樣品在96孔板中是成列或垂直方向排列即可。

我們建議您在送樣前保留一份樣品的備份，防止樣品在郵寄過程中丟失等不可抗拒的因素影響。

為了積極響應政府疫情防控號召，即日起，我司暫停進行與新冠病毒N基因和ORF1a/1b（全序列或部分序列）相關的測序服務。

在測序儀中，每個含熒光標記末端的片段，經毛細管電泳至指定位置時會釋放出熒光信號，該信號被CCD圖像傳感器捕獲。記錄下熒光信號的峰值被最終整理生成軌跡數據文件（即序列圖譜，*.ab1文件）。不同的堿基使用不同顏色的熒光標記，使用序列分析程序即可根據這些峰值判斷出對應的堿基。

堿基的質量值(Quality Value)用于量化評估該堿基的可信度，由序列分析程序根據該堿基的峰形計算得出（QV = -10log10Pe；Pe—Probability of Error, 誤差率）。QV越高，誤差率越低。QV與Pe的對應關系為： 質量值（QV） 誤差率（Pe） 1～10 79%- 10% 11-20 7.9%-1.0% 21-30 0.79%-0.10% 31-40 0.079%-0.010% 50及以上 0.001%及以下

測序結果的序列質量得分(Quality Score, QS)是序列中所有堿基質量值(Quality Value)的平均值，用于判斷測序結果整體的可信度。 關于有效讀長，安升達選用的標準為序列連續讀長(Contiguous Read Length，CRL)。即整個序列中，各個堿基質量值均大于20(可信度大于99%)的片段里，最長片段的長度。

測序結果無任何明顯干擾，前800bp連續可讀。通常菌液或質粒樣品，一個測序反應讀長可達1000bp，由于Sanger測序的局限性前50bp可能存在誤差；PCR產物測序常以終止信號A尾結束。

點擊查看峰圖實例。

建議您在目標序列上游100bp處設計測序引物。如果沒有緩沖區域，就在序列上游的50-60堿基處設計引物。但是與目標序列越靠近，就越容易錯過部分目標序列。引物的長度應為18-24bp，退火溫度為56-60℃，GC含量為45-55%。您也可以利用引物設計軟件來設計引物，主要影響因素包括引物的Tm值、GC含量和二聚體。

可以。如果您知道引物的序列，僅需要在測序訂單中注明即可。如果您需要安升達為您設計引物，請在訂單中注明目標序列中的相關信息發郵件至Support.Asia@Azenta.com。

請點擊查看安升達提供的通用引物。
您可以使用同一頁面中的安升達通用引物選擇工具，查詢測序所需的引物。

如果首次未擴增出片段或濃度無法達到測序要求，我們默認會根據實際情況調整方案重新擴增，若兩次均擴增失敗則更新為重新擴增失敗的狀態。

擴增后得到的片段有時會存在非特異性條帶，需要進行切膠純化。樣本在回收過程中就會出現一定的損耗，導致得到的已純化PCR產物濃度無法達到測序要求。

我們可以免費為您解決測序過程中遇到的各種難題。如果測序失敗，我們會發送給您一份說明文件，標注出失敗原因，您也可以聯系我們的技術支持 ，或者發送郵件至Support.Asia@Azenta.com來尋求幫助。

針對無信號、高背景和衰減三種失敗類型，我們將按照一定的比例安排重測，若重測結果成功，則將與其失敗原因相同的其他樣品按照同樣的方法安排重測。您可以聯系我們的技術支持 ，或者發送郵件至Support.Asia@Azenta.com來尋求幫助。

當聚合酶遇到序列中的polyA或polyT時，往往會發生移滑，進而導致測序結果的非特異性或不理想。每當出現這種情況時，我們就會建議進行反向測序，以得到缺失的序列數據。

引物越長，Tm值就越高，測序反應過程中的DNA模板就越不容易退火，可能就會產生不理想的結果。我們建議您使用安升達通用引物或者您自己設計的引物長度要在18-24bp之間，退火溫度為56-60℃，GC含量為45-55%。

最有可能的原因是引物降解，另一個原因可能是您的PCR引物雖然適合于PCR反應，但是不適合用于測序反應。我們建議您的測序引物長度在18-24bp之間，退火溫度56-60℃，GC含量為45-55%。PCR引物越長，測序結果可能越不理想。而且，并不是所有的PCR引物都適合被用做測序引物。如果您的PCR引物對測序結果不利，我們建議您設計巢式引物來作為測序引物。

Sanger測序常見的失敗類型如下，請點擊鏈接查看具體的原因及解決辦法。

Poly結構或重復序列	高背景
光譜拉高	彌散
氣泡	衰減
套峰	無信號
引物問題	中斷

由于樣品的保存期為1個月，因此有效投訴期為1個月之內，1個月后視為無效投訴，不予處理。