對于客戶提交的原始樣品或提取后的核酸樣品，如有剩余，項目交付日期起2個月內(含2個月)免費保存，超過2個月即進行樣品清理。如需返樣請在項目交付后一周內通知項目管理，相關費用客戶自理。

安升達在收到樣品和完成樣品檢測時都會向客戶發送郵件。此后， 安升達每周向客戶更新一次項目進展，直到項目結束。

安升達非常注重客戶信息的保密性及保護知識產權的安全性，并對結果嚴格保密，不會泄露給第三方。如需獲得更多信息，請查閱安升達保密政策。

請在樣品到達我方實驗室前，給安升達項目管理團隊發送一份填寫完整的電子版 《安升達高通量測序樣品信息單(組織或核酸)》。隨同樣本包裹附上紙質版《安升達高通量測序樣品信息單》，將樣本置于適當的包裝箱中（干冰、藍冰或者室溫），選擇速度最快的運輸方式寄送至如下地址：

收件人：安升達高通量測序服務
收件地址：中國蘇州工業園區科教創新區醞慧路8號
電話：15599039790
郵編：215000

國際訂單：請選擇最快的運貨代理商，確保您的樣品包裝完好溫度適宜，并將您的包裹追蹤信息發送給安升達。因為國際貨運需要清關，所以請保留足夠量的樣品，以防您需要再次向安升達提交材料。

轉錄組測序是利用深度測序技術研究特定組織或細胞在某個時期轉錄出來的所有mRNA，可以對樣品中的mRNA序列進行全面的定量和分析。轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發點，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。

基因芯片技術是預先針對已知序列設計探針進而捕獲和定量特定的RNA序列。這意味著基因芯片技術只能檢測預先選擇好的轉錄本，如果樣本mRNA以前從來沒有報道過，那么基因芯片上面就不會有相應的探針序列，也就檢測不到新的mRNA。而高通量轉錄組測序技術能夠對任何樣品的RNA（包括已知序列和未知序列）進行鑒定和定量分析。

轉錄組是直接對樣本mRNA進行測序，優勢顯著：
1）可以直接測定每個轉錄本片段序列、單核苷酸分辨率的準確度，同時不存在傳統 微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題；
2）靈敏度高，可以檢測細胞中少至幾個拷貝的稀有轉錄本；
3）可以對任意物種進行全基因組分析，無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進行轉錄組分析，同時能夠檢測未知基因，發現新的轉錄本，并準確地識別可變剪切位點及cSNP，UTR區域；
4）檢測范圍廣，高于6個數量級的動態檢測范圍，能夠同時鑒定和定量稀有轉錄本和正常轉錄本。 

測序所需數據量依物種基因組大小和已知基因、轉錄本數目及研究目的而定。由于不同物種間轉錄組大小差異較大，所以測序前需要對轉錄組大小進行評估：① 針對有參考基因組的物種，可通過分析基因組信息，統計編碼基因個數及其堿基數來評估轉錄組的大小，同時也可參考相近或相關物種轉錄組研究的文章;② 針對無參考基因組的物種，只能參考相近物種的轉錄組大小。對于小型基因組(如細菌)來說，我們推薦10M reads;大型基因組(如：人和小鼠)則推薦20-30M reads。所測reads數越多得到的有效數據量越大，這能增加低表達量基因的檢出率。需要注意的是，足夠的數據量是確保下游數據分析結果可靠性和準確性的必要條件，如果數據量過低會造成無法分析，建議您提前咨詢技術支持確認測序數據量。

對于轉錄組測序，我們一般采用HiSeq 150PE測序。

安升達建議起始材料送總RNA，同時，我們也接受ds-cDNA、mRNA、細胞、血液和組織等樣品。

總RNA及其他樣本要求可參閱“樣品制備指南”頁面或咨詢技術支持。

安升達擁有專業的生物信息分析工程師，可以提供標準分析服務和高級分析(定制化分析)服務，如果客戶不需要 數據分析，默認提供FASTQ格式的原始數據。 針對轉錄組測序，我們提供的標準數據分析內容包括：

真核有參轉錄組

1.測序數據質量分析

2.參考基因組序列比對分析

3.基因表達分析

4.RNA-seq整體質量評估

5.基因差異表達分析

6.GO功能富集分析

7.KEGG功能富集分析

8.可變剪切分析

9. 新轉錄本預測

10. SNV和InDel 分析

11. 外顯子表達水平分析

12. 主成分分析

13.互作網絡分析

14.基因融合分析

15. RNA編輯分析

16. LncRNA預測和功能分析

17.共表達網絡分析

 

LncRNA分析內容

1.原始數據質量控制

2.參考基因組比對

3.轉錄本組裝

4.基因表達分析

5. RNASeq整體質量評估

6.差異分析

7.GO富集分析

8.Pathway富集

9.可變剪切分析

10.新轉錄本預測

11.SNV分析

12. lncRNA鑒定和預測

13.lncRNA統計

14.lncRNA靶基因預測

15.差異lncRNA

16.差異lncRNA靶基因功能分析

17. 差異lncRNA與靶基因互作分析

 

無參轉錄組分析

1.測序數據質量評估

2. 序列組裝

3. Unigene注釋

4. 參考序列比對分析

5. 基因表達分析

6 .SSR分析

7. 差異表達分析

8. 功能富集分析

9. RNA-seq整體質量評估

10 .SNP分析

11. 互作網絡分析

 

原核有參轉錄組

1.原始數據質量控制

2.參考基因組比對

3.新轉錄本預測

4.SNV分析

5.基因表達分析

6.RNASeq整體質量評估

7.差異分析

8.富集分析

9.基因結構分析

10.UTR分析

11.sRNA預測

12.互作網絡分析

13 共表達分析

 

smallRNA分析內容

1.測序數據質量評估

2.microRNA注釋及新microRNA預測

3.miRNA家族分析

4.表達差異分析

5.功能富集分析

 

circleRNA分析內容

1.測序數據質量分析

2.與參考基因組比對分析

3. CircRNA 鑒定及注釋

4. CircRNA差異表達分析

5. 差異表達CircRNA來源基因分析

6. ceRNA分析

 

另外，如有個性化分析內容請和安升達項目管理團隊溝通。

安升達有經驗豐富的技術支持團隊，可以協助客戶明確實驗目的，設計實驗方案。如需幫助，可通過電子郵件或電話：400-8100-669 轉 3 進行咨詢，也可聯系所屬區域銷售。

對于真核生物mRNA轉錄本，我們一般使用 poly-A選擇方法來富集。采用何種方法，這取決于您的樣品需求，有時去除核糖體RNA更好。有些物種具有大量的核糖體RNA，或者不含有poly-A結構，對于這樣的樣品，我們推薦使用核糖體RNA去除。如果您需要檢測多種類型的非編碼區，如長的和短的非編碼RNA，那么我們也推薦核糖體RNA去除方法。

總RNA中大約有80%-90%的序列是rRNA序列，因而在測序前先要獲得mRNA樣品。真核生物一般通過oligo(dT)富集帶有poly-A尾的mRNA，但對于不含有polyA尾的轉錄本序列或存在降解的總RNA樣品，此種方法不適用。對于這類樣品以及原核生物樣品，我們會使用rRNA去除法(采用相應試劑盒)來獲得mRNA序列。還有檢測多種類型的非編碼RNA序列時，如長的和短的非編碼RNA，也會采用rRNA去除法。

之后會將mRNA片段化然后用隨機引物反轉錄構建測序文庫。

安升達可以對少量的樣品起始材料進行測序，但是我們不能保證整個實驗的結果。

如果選擇的近緣物種基因序列高度相似，可以利用已公布的近緣物種基因組數據做參照進行后續信息分析，但我們推薦先進行denovo組裝，利用denovo組裝的序列做參考進行后續基因差異表達分析與功能富集分析等。

轉錄組測序后可選取有代表性序列使用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術來驗證測序結果?；虻奶暨x原則：首先，要根據自己的實驗目的選擇，從GO和KEGG的聚類分析結果入手，選擇差異表達基因；其次，選擇基因表達量高的基因，至少在一個樣品中的表達量（RPKM或FPKM）大于50；根據基因序列能設計出合適qPCR引物。

基因的表達水平用FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads）來衡量。原始的描述請參考：http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n7/abs/nmeth.1226.html。

簡單的說，FPKM是針對個體轉錄本的長度，來正?；瘡姸壬系牟町?。

qPCR檢測和NGS測序這兩種方法本身在實驗原理和流程上存在很大差異，數據分析的原理也不一樣，部分結果存在的一定的差異屬于正常情況。一般推薦選擇NGS測序中基因表達量高，差異顯著的基因進行qPCR驗證。另外以下幾方面也會對qPCR驗證的一致性產生影響：沒有用同一批樣品來做實驗；樣品中有其他物種污染或rRNA污染致使轉錄組測序的基因表達量不準確；做QPCR驗證的基因表達量偏低，差異不顯著。在保證實驗無誤的情況下，基因表達水平以qPCR為準。

全基因組重測序是對基因組序列已知物種的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異信息分析的方法。

de novo測序也稱為從頭測序，不依賴于任何參考序列就可以對某個物種進行測序并利用生物信息學分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。

安升達可以接受多物種多類型的樣品，gDNA、細胞、血液、新鮮組織、冷凍組織、石蠟切片（FFPE）、制備好的文庫等多種類型的樣品都可以送至公司檢測。如您不能確定是否可以檢測，可以通過郵件或電話咨詢。

Email： NGS.Service@Azenta.com

Tel: 400-8100-669 轉 3（免費）

從個體角度來講，人出生時可能就攜帶了一些致病基因，在之后的生活過程中，可能又有一些基因突變導致諸如癌癥等疾病的發生，通過全基因組測序可全面挖掘DNA水平的遺傳變異，為篩選疾病的致病及易感基因，研究發病及遺傳機制提供重要信息；同時對基因治療、風險人群的疾病預防、環境因子等方面的研究具有重要意義。 從群體水平來講，全基因組測序對研究不同人種的親緣關系和研究生物進化提供分子水平的支持。

根據不同的研究目的，測序深度的選擇是不一樣的。測序錯誤率或變異檢測（如SNP）假陽性結果會隨著測序深度的提升而下降，根據統計，當測序深度達到30X時，SNP檢測才會達到飽和，所以個體的全基因組遺傳信息檢測推薦30X測序深度，癌組織檢測推薦50X及以上，以保證中低頻變異的檢測成功率；群體遺傳學分析時是通過計算基因組不同區域的多樣性變化來推斷，一般10X測序深度即可滿足要求。

基本的信息分析包括數據質控，與參考基因組進行比對、統計測序深度及覆蓋度，全基因組區域的SNV/InDel檢測及注釋，樣品間差異SNV/InDel統計，Somatic SNV檢測（癌組織），突變位點對應基因的GO富集和KEGG富集分析，基因組結構變異分析（CNV、SV）。另外，我們公司可以根據您的需求提供個性化的高級分析服務，詳情請與技術支持聯系溝通。

通過全基因組重測序一般能夠發現SNP、InDel、SV、CNV等多種遺傳變異，不同的變異類型，其驗證方法也不相同： ① SNP和InDel可以通過一代測序的方法進行驗證，即設計引物PCR擴增包含該SNP/InDel位點的區段，并進行Sanger測序；② CNV可通過Real-time PCR對存在拷貝數變異的片段進行擴增，并根據CT值估算不同個體的拷貝數變化倍數。 ③ 小的SVs可通過PCR擴增和測序辨別，而大的SVs則需要通過亞顯微方法發現，如FISH等。

提交基因組信息到NCBI數據庫的主要步驟如下：

1）申請一個NCBI賬號。
2）給提交的物種申請bioproject。https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/
3）有了bioproject號，再通過WGS提交基因組序列。

可參考：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/wgs/ 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/eukaryotic_genome_submission 
注意：提交序列時一般小于200bp的序列要去掉； 如果提交contig序列，則不能含有N；一般不直接提交fasta序列，需用軟件轉換為sqn文件提交。數據公開時間可以選擇的，不是提交后立即發布了，可以根據自己的需求選擇延后時間。

靶向測序/目標區域測序是通過雜交或擴增方法富集基因組中感興趣區域然后利用高通量測序技術進行測序。通過對大量樣本的目標區域進行研究，有助于發現和驗證疾病相關候選基因或相關位點，在臨床診斷和藥物開發方面有著巨大的應用潛力，并且此方法還能有效節約單個樣品的研究成本。

全基因組信息量非常龐大，而靶向測序/目標區域測序可以去掉不感興趣的區域只研究感興趣的基因區域，這樣大大減小了目標序列長度。而對于特定的NGS平臺和配置來說，數據輸出量是保持不變的，所以靶向測序能夠在同一條run中混合更多樣品或是提高樣品測序深度及覆蓋度。在同一run中安排更多樣品測序，就可以大大降低項目的測序成本；提高樣品的測序深度就能增加檢測的靈敏度，從而檢測到低頻的稀有突變并能測序分析更復雜（高GC/AT）的基因區域，所以有明確的目標區域時，靶向測序/目標區域測序是最佳選擇。

外顯子組測序是靶向測序/目標區域測序的一種形式。但是，靶點尺寸比大多數定制靶向區域大得多。因此，較之全基因組測序，其具有相同優點。

實驗設計過程可以從相對簡單到極其復雜，這之間難易跨度很大。

設計過程中的某項關鍵要素包括：

• 確定采用擴增子測序還是靶向富集
• 確定最佳的擴增子或是富集化學過程/技術
• 針對具體區域/基因確定最佳設計（例如針對高GC或復雜區域設計最佳方案會比較難）

安升達在靶向實驗設計方面具有豐富的經驗，開發了多種內部專有基因檢測平臺（panels），并為具體應用（例如，為癌癥研究進行優化的OncoGxOne™ Discovery cancer panels）進行優化。 

該技術的應用包括但不限于：

• 發現普通和稀有遺傳突變，其中包括點突變、插入/缺失（Indels）、拷貝數變異（CNVs）和基因重排。
• 將基因相關性表征為某一具體表型，例如疾病狀態或藥物反應。
• 對細胞系（其中包括真核細胞和原核細胞）進行分型分類。
• 發現抗體，包括從噬菌體展示文庫和離體選擇中發現抗體。
• 遺傳檢測，例如藥物基因組學化驗或腫瘤學化驗。

如需獲得更多信息，請聯系安升達專業團隊NGS.Service@Azenta.com。

外顯子組測序(whole exome sequencing)是利用序列捕獲技術將外顯子區域DNA捕捉富集后，進行高通量測序的基因組分析方法。已經被廣泛應用于研究遺傳病和癌癥的致病機理等研究領域。

1. 更高性價比：外顯子組區域包括85%的疾病相關的突變信息，卻不到全基因組的2%，使得研究的成本大大降低，而且外顯子區域發生的突變大多是和功能息息相關的。

2. 高深度測序：外顯子組測序針對目標區段的測序深度和覆蓋度都遠高于全基因組重測序，因此使用它來檢測低頻突變十分合適，可以滿足一些罕見突變導致的疾病和腫瘤的研究需要

但是外顯子組測序只能獲得外顯子區域內部或邊界的變異信息，不能檢測到基因組內較大的結構性變異，也不能提供基因拷貝數變異的信息。全基因組測序能提供更加全面的基因組信息，測序數據也更加均勻和可信。

外顯子組測序最為主流的三個捕獲平臺為Agilent、NimbleGen、Illumina，其中又以基于液相探針雜交捕獲技術的Agilent平臺最常用。目前，該技術廣泛應用于遺傳病和癌癥相關的遺傳變異研究中，并獲得了國際癌癥協會(ICGC)的鑒定認可，具體參數見下表：

指標	Aglient	Roche	Illumina
探針類型	RNA探針;與DNA形成RNA-DNA結構，比DNA探針形成的DNA-DNA結構TM值高，更穩定;	DNA探針;	DNA探針;
捕獲效率	高	較好	略差
捕獲區間	SureSelect Human All Exon V6試劑盒，60M	NimbleGen Sepcap EZ Exome試劑盒，64M	/
數據庫注釋	數據庫注釋率最高	數據庫注釋最多	/
市場認可度	高	較高	較差

安升達數年來堅定不移地提供一流的服務，成為DNA測序和基因組學領域的全球帶頭人。

1. 專業可靠的方案設計：經驗豐富的技術團隊，結合研究目的和科研熱點，提供多項實驗方案以供選擇

2. 嚴謹規范的實驗操作：ISO9001質量體系認證，官方原裝試劑和行業最規的范執行標準，捕獲效率等指標遠高官方標準

3. 靈活多樣的生信分析：行業頂尖的Bio-IT服務器，個性化服務提供可直接文章發表的結果

4. 及時高效的售后服務：多節點把控項目質量，定期售后回訪，主動解決客戶疑問

5. 一站式下游銜接服務：提供下游sanger測序、CRISPR基因編輯、引物合成等額業務，完美銜接測序分析結果

安升達提供癌癥研究外顯子測序(CA_WES)和疾病研究外顯子測序(DIS_WES)兩種產品。

CA_WES產品的分析內容如下：

1. 測序數據質控

2. 測序數據與參考基因組比對

3. Normal樣本的Germline SNV/Indel檢測、注釋及過濾

4. Somatic SNV/Indel檢測、注釋及過濾

5. Somatic CNV檢測與注釋

6. 遺傳易感基因篩查

7. 驅動基因篩選與鑒定

8. 突變頻譜及特征分析

9. 高頻突變基因鑒定、富集分析及相關性分析

10. 高頻CNV分析

11. 雜合性缺失(LOH)分析

12. 融合基因分析

13. 全局變異circos圖

14. 其他個性化分析

 

DIS_WES產品分析內容如下：

1. 測序數據質控

2. 測序數據與參考基因組比對

3. SNV/Indel檢測與注釋

4. CNV檢測與注釋(樣本數不少于8,且需要提供control)

5. 顯隱性遺傳模式篩選

6. 新生突變篩選

7. 連鎖分析

8. 純合子分析

9. SNP顯著性分析

10. 候選基因篩選

11. 候選基因功能富集

12. 蛋白互作網絡

13. 候選基因的疾病相關性排序

14. 其他個性化分析

1. 對未知樣品進行快速種屬分析

2、為生化鑒定提供指導信息

3、對于難以獲得純培養的細菌，如寄生菌等。16S宏基因組學用于鑒定樣本中細菌和古生菌的類型和相對豐度。該技術能夠非常有效地處理不均勻樣品，例如土壤或腸道菌群和其他微生物組。

目前常用的16S宏基因組學技術采用的是單引物對，擴增16S rRNA基因的V4區。16S MetaVx™采用了獨特的引物設計，可以同時擴增16S rRNA基因的V3、V4和V5區。

對比16S MetaVx™和傳統的16S宏基因組學技術，16S MetaVx™具有更高的靈敏度和特異性，能夠鑒定許多樣本中更多的細菌和古生菌種類。

16S MetaVx™測序可提供以下標準分析內容：

1. 去除Adaptors和低質量reads
2. OTU 分析
3. Rank-Abundance曲線
4. 物種分類分析
5. 稀釋性曲線 (Rarefaction curve)
6. Alpha多樣性分析
7. Beta多樣性分析 (3個樣本以上)
8. PCoA分析 (3個樣本以上)
9. UPGMA聚類樹 (3個樣本以上)

另外，如有個性化分析內容請與安升達項目管理團隊溝通。

宏基因組測序可提供以下標準分析內容：
1. 去除低質量Reads 和Adaptors
2. 宏基因組組裝（多個樣本默認分別組裝，合并后聚類進行后續分析）
3. 物種組成和豐度計算
4. 基因預測
5. 構建非冗余基因集
6. 基因豐度統計
7. 基因功能注釋 （eggNOG、KEGG和CAZy）

另外，如有個性化分析內容請和安升達項目管理團隊溝通。

1.去除低質量Reads 和Adaptors

2.轉錄本組裝

3.Unigene功能注釋

4.Unigene表達分析

5.Unigene表達差異分析

6.樣品間的差異基因GO富集和Pathway富集分析

7.差異比較分析

另外，如有個性化分析內容請與安升達項目管理團隊溝通。

文庫樣品我們不接收小RNA和甲基化文庫樣品的散樣測序，只接收小RNA和甲基化文庫樣品的包Lane測序;除此之外，其他Illumina兼容的文庫樣品均可接收。

A. 散樣測序：文庫濃度大于3 nM(qPCR定量濃度)、體積不低于15μl且樣品中不含有磁珠;文庫兼容相應的測序平臺;

包Lane測序：文庫濃度大于5nM(qPCR定量濃度)、體積不低于15μl且樣品中不含有磁珠;文庫兼容相應的測序平臺;

B. 如果送樣體積低于15ul，我司默認稀釋到15ul再進行后續實驗操作;

C. 如果樣品中含有磁珠，我司默認去除樣品中的磁珠，再進行后續實驗操作;

D. DNA文庫溶解于Illumina Resuspension Buffer(RSB)或其他品牌建庫試劑盒的適當緩沖液中;

E. 提供Index 序列、片段大小(根據2100結果判斷)、建庫方式;選擇提供Agilent 2100 Bioanalyzer質檢圖以及Qubit結果;

F. Hiseq文庫大小介于300bp-500bp之間，Miseq文庫大小介于300bp-600bp之間，無引物二聚體及接頭二聚體;

A. Qubit熒光定量儀檢測

熒光染料只和特異性的DNA、RNA、蛋白質結合，測定所有的雙鏈DNA的濃度;最少僅需1ul樣品即可檢測出文庫的濃度;

B. Agilent 2100 Bioanalyzer檢測

基于芯片實驗室技術的核酸分析系統，通過微流體技術對不同片段大小的樣品進行分離，檢測出文庫的片段大小和峰形;

C. qPCR檢測

利用P5和P7的引物進行檢測有效文庫的濃度;

A. 文庫峰形較寬，這是由于文庫制備過程中，片段大小篩選不夠集中，片段大小均一性比較差。

B. 文庫含有大片段，這是由于文庫制備過程中，大片段去除不完全。

C. 文庫峰形不單一，如有引物二聚體或接頭二聚體等，這個需根據客戶文庫類型判斷。

特殊文庫主要有擴增子文庫、甲基化文庫、small RNA等堿基不平衡的文庫;插入片段超過550bp文庫;抗體測序;文庫含有接頭。

客戶指定測序引物推薦合成的量2nM，每條lane需要使用測序引物總量不低于200μmol且濃度不低于1μM。

病毒測序可提供以下標準分析內容(需提供宿主參考基因組，及其他物種污染參考基因組)：

1. 去除Adaptors和低質量Reads

a) 提供PF 和Clean data的統計分析表

b) 提供測序PF數據不同位點堿基質量分布圖，GC含量分布圖，測序reads堿基平均質量分布圖

2. 宿主及其他物種污染評估與去除

3. 病毒基因組組裝分析

4. 組裝結果評估

5. 編碼基因預測

6. 基因功能注釋(Nr數據庫)

另外，如有個性化分析內容請和安升達項目管理團隊溝通。

ChIP-Seq測序可提供以下標準分析內容：

1. 去除低質量Reads 和Adaptors
2. ChIP 測序序列與參考基因組序列的比對
3. ChIP 測序 Reads 在全基因組的分布
4. 統計ChIP測序數據富集區域 ( Peak ) 的信息
5. 基于Peak相關基因功能分析

另外，如有個性化分析內容請和安升達項目管理團隊溝通。

 

1.去除低質量Reads 和Adaptors

2.參考受體庫比對

3.VDJ基因使用頻率分析

4.CDR3長度分析

5.飽和度分析

另外，如有個性化分析內容請和安升達項目管理團隊溝通。