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      引物合成常見問題


      引物常見問題解答

      A:
      我們的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L(即100pmol/ul)濃度的加水量,您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水(PH>6.0)或TE緩沖液(PH 7.5-8.0),開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉/分鐘的轉速下離心1分鐘,防止開蓋時引物散失。
      A:
      沒有溶解的引物非常穩定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液,分裝數管保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反復多次凍融會降低使用壽命)。使用前,將濃溶液稀釋成工作液后進行實驗。
      A:
      用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量,測定時溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后,取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色皿中測定其吸光度,即為所測體積的OD值,進而可以計算出母液的OD值。
      A:

       

      1OD值的Oligo的重量約為33 μg,而每個堿基的平均分子量一般按330道爾頓進行計算。因此,合成Oligonmol數一般按以下公式粗略地計算:

      nmole=(ODx33μg)/(堿基數x330)x1000=OD/堿基數x100

      如果需要計算合成DNA的精確濃度,請按以下公式進行計算:

      nmole=OD*(10^6/ Millimolar Extinction Coefficient)

      *Millimolar Extinction Coefficient采用最近鄰二態模型進行消光系數的計算,參考數據為Michael于2003年發表于《Nucleic Acids Research》的文章(DOI: 10.1093/nar/gnh015)。

      A:
      通常在合成長鏈引物時,試劑的加入量要比短鏈引物多很多,尤其是大于90bp以上的引物,由于成本的增加,從而導致價格也要增加。

      DNA合成常見問題

      A:
      實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,<12個堿基的引物用20%的膠,12-60個堿基的引物用16%的膠,>60個堿基的引物用12%的膠,取0.2OD左右的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,容易加樣。600V電壓進行電泳,一定時間后(約2-3小時),剝膠,用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的(有時由于變性不充分,主帶之上可能會有條帶,乃是引物二級結構條帶)。
      A:
      沒有,5和3末端均為-OH基。如需要加磷酸基團,則需要使用修飾合成增加磷酸化。
      A:
      由于核酸在260nm附近有強吸收,而蛋白質在280nm附近有強吸收,從生物體內提取核酸時,常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.8~2.0之間),這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結果。而合成的DNA/RNA則不同,序列很短 (通常在20~30個堿基之間),其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同,由于各種堿基的摩爾消光系數不同,因此不同堿基構成的引物的A260/A280比值也不同,例如當序列中C、T堿基的含量高時,該比值會大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度。
      A:
      對引物進行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA,容易形成復雜的立體結構,因此進行Agarose電泳時,容易出現多條泳帶,更無法用Agarose電泳進行定量了。
      A:

      PCR反應失敗的原因很多,可以從以下幾個方面考慮。

      • 引物和模板是否配對,同源性有多大;
      • 引物本身是否有立體結構;
      • PCR反應用試劑是否能正常工作;
      • PCR儀是否工作正常;
      • PCR反應條件是否合適;
      • 如果一切正常,還無法解決問題時,我們可以免費重新合成引物。
      A:
      不能。因為EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈,只有通過自身回折形成局部發夾環結構或鏈間形成部分雙螺旋結構,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成雙螺旋的能力不同,因此染色能力不盡相同,也就不能根據EB染色帶的亮度來對合成的DNA進行定量。
      A:
      • 因為引物純度不可能是100%,因此,挑選克隆時,有可能挑選了雜質引物擴增出的PCR產物的克隆。此時,請重新挑選一個克隆測序,會得到正確的結果。
      • 如果挑選2 ~ 3個克隆測序情況還沒改觀,我們會免費重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。
      • 如進行索賠時,按國際行業慣例,索賠范圍限于制品價格范圍之內。

      qPCR引物探針常見問題

      A:

       

      引物設計原則

      擴增片段大小

      80-300bp

      Primer長度

      17-25 堿基

      GC含量

      40-60%(最好45-55%

      Tm

      57-63℃,兩條引物的Tm值盡量接近,差距不得超過5。

      序列

      整體上堿基不能過偏,局部避免GC richAT rich(特別是3’端)

      3’末端序列

      避免GC含量過高,3’末端堿基最好為GC,盡量避免3’末端堿基為T,3’端最后一個堿基不能互補自連。

      互補性

      引物內部或Probe與兩條引物之間避免3 個堿基以上的互補序列,引物3’末端避免2 堿基以上的互補序列

      特異性

      保證單一結合位點,使用BLAST檢索,確認引物特異性

      RT-PCR用引物

      盡量在Exon junction上設計引物,限制基因組DNA擴增。

       

      探針設計原則

      Probe長度

      20-32 base

      Tm

      探針的Tm比引物高8-10℃

      序列

      在目的序列GC含量相對較高的區域設計,整體上堿基不能過偏,局部避免GC richAT rich(特別是3’端)

       

      探針序列盡量接近正向或反向引物,但不能重合一般相隔10個堿基以內,相隔一個堿基最好。

      5’末端序列

      探針5’末端的第一個堿基不能是G

      互補性

      Probe內部或Probe與兩條引物之間避免3 個堿基以上的互補序列

      特異性

      保證單一結合位點,BLAST檢索確認Probe特異性

      A:
      需要避光在-20℃環境下保存,使用棕色管分裝,優先推薦使用TE Buffer來稀釋并保存探針(也可以使用弱堿性的nuclease-free H2O),建議事先稀釋為100μmoL/L的儲存液,分裝數管保存于-20℃冰箱,避免反復多次凍融降低使用壽命。使用前,將儲存液稀釋成工作液后進行實驗即可。
      A:
      使用較高濃度的模板按3~4個梯度稀釋,并使用其進行Real Time RT-PCR反應或Real Time PCR反應。如果無抑制物質存在,得到的Ct值會依存模板濃度的變化而變化;如果有抑制物質存在,就會發現高濃度的模板有反應性能下降的現象。 抑制物的影響或可通過稀釋樣本消除
      A:
      目的不同 絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目,即通常所說的拷貝數。絕對定量需要制作標準曲線。 相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。 原理不同 相對定量:利用CT值與起始DNA濃度的對數成反比的數學關系,來計算不同樣本之間的相對百分比。 絕對定量PCR:是利用熒光信號的變化,實時檢測PCR擴增反應中每次循環擴增產物量的變化,通過循環閾值和標準曲線的分析對標本中起始模板拷貝數進行定量分析。
      A:
      模板量過高及基線范圍設置不當,建議重新設置基線范圍(基線終點設計為Ct值-4)。
      A:

      儀器需要校準,可能在擴增過程中儀器出現波動或者檢測孔本身出現異常,建議定期校準儀器。

      擴增信號太弱,經系統矯正后,就會產生不平滑的線,可以通過提高模板濃度和純度重復實驗。

      A:
      原因可能為ROX參比染料設置不當,應仔細對比儀器所需的ROX參比染料類型,設定參比為None觀察是否擴增曲線恢復正常。
      A:
      反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 反應條件不夠優化:可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。 反應體系中有PCR反應抑制物:一般是加入模板時所引入,應先把模板適度稀釋,再加入反應體系中,減少抑制物的影響。 引物設計的不夠好,容易形成二級結構或是不易退火,重新設計新的引物進行實驗。 試劑未充分混勻或移液誤差,建議重復實驗。 qPCR試劑的影響:試劑中DNA聚合酶濃度較低或Buffer中離子濃度非最優化,導致Taq酶活力未達最強。
      A:
      原因可能為模板濃度太低、體系有抑制和擴增效率低,建議適當提高模板濃度,優化反應條件(見擴增效率低),或嘗試更換試劑。
      A:
      原因可能為模板濃度過高,體系內有污染,引物形成二聚體。建議適當增加稀釋比例,更換所有試劑杜絕污染,重新設計不容易形成二聚體或非特性擴增的引物序列。
      A:
      擴增曲線存在問題時,首先應確認基線校正或ROX校正前的原始曲線,擴增曲線的熒光信號值低多數是由于背景熒光信號值過高造成的。 使用SYBR Green染料法進行檢測時,背景熒光信號偏高大多數是由于模板量過高,染料嵌入到初始模板DNA中發出熒光造成的。使用探針法進行檢測時,背景熒光信號偏高大多是由于設計的探針質量差使淬滅基團的淬滅作用不充分、報告基團和淬滅基團的搭配不合理、探針的熒光標記效率低等原因造成的。
      A:
      分液不準確,檢查檢測后的反應管可發現管內的PCR反應液量明顯少于正常管; 反應管氣密性差,反應過程中溶液蒸發引起探針濃度增加,導致曲線呈斜直線狀。
      A:
      反應體系污染,建議從水,引物,酶和環境等逐一排除污染。試劑暴露在強光或高溫下導致試劑失效,建議用新的試劑做對比實驗。儀器長時間未校準。
      A:
      可能原因是引物二聚體形成或引物特異性較差,建議重新設計引物。 雜峰在主峰之前,Tm約為70-75℃——一般為引物二聚體,可以嘗試重新設計引物或提高模板濃度、退火溫度或者降低引物濃度來進行改善;另外,當目的基因表達量極低時,染料法容易形成引物二聚體產物影響實驗結果,此時,建議使用探針法定量。 雜峰在主峰之后,可能是引物特異性不好引起的非特異性擴增,也可能是空氣中有氣溶膠污染所導致。
      A:
      原因可能是有Tm非常接近的雙鏈分子,建議使用瓊脂糖電泳分析一下產物,觀察條帶情況。
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