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高通量測序

樣品制備指南

DNA樣品

DNA樣品建議在-20℃環境中保存。短時間保存或運輸可以使用濕冰或者冰袋，4℃保存或運輸。長時間運輸，建議采用干冰加冰袋的方式。

測序類型	文庫類型	樣品要求
基因組測序	小片段文庫	核酸質量≥200ng以上，濃度大于10 ng/μl，體積大于10 μl。瓊脂糖凝膠電泳DNA條帶清晰無降解或輕微降解，無RNA和蛋白污染，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
	Pacbio文庫(10K 文庫)	核酸質量≥5μg以上，濃度大于60 ng/μl，OD260/280比值 1.8-2.0，260/230 比值2.0-2.2。Nanodrop 濃度與 Qubit濃度比值≤2，樣品澄清無色，無不溶解物；瓊脂糖凝膠電泳DNA條帶清晰無降解，無RNA和蛋白污染。
	Pacbio文庫(20K 文庫)	核酸質量≥ 20 μg以上，濃度大于80 ng/μl，OD260/280比值 1.8-2.0，260/230 比值2.0-2.2。Nanodrop 濃度與 Qubit濃度比值≤2，樣品澄清無色，無不溶解物；脈沖電泳DNA條帶清晰無降解或輕微降解，大于30kb，無RNA和蛋白污染。
宏基因組測序	宏基因組樣品建庫成功率受樣品來源和雜質含量等影響較大，成功率較常規gDNA 建庫低	核酸質量≥100ng以上，濃度大于2 ng/μl，體積大于10 μl。瓊脂糖電泳條帶片段大小≥500bp。
16S/18S/ITS測序	對于達到QC 標準(基因組濃度大于0.05ng/ul)的樣品，16S/18S/ITS測序同樣存在擴增失敗的風險	擴增結果體積≥15ul，擴增結果濃度≥10nM，且2100 峰圖正常，基因組濃度大于0.05ng/ul。
染色質免疫共沉淀測序(ChIP-Seq)		核酸質量≥20 ng以上，濃度≥1ng/μl，體積≥10μl，主峰在100-500bp之間Smear條帶。樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物，無蛋白污染。
全基因組甲基化測序		核酸質量≥1.5μg，濃度≥20ng/μl，體積≥10μl。瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰無降解或輕微降解，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
外顯子測序	基因組樣本,基本無降解（數據量＜50G）	核酸質量≥300ng以上，濃度≥2ng/μl，體積≥10μl。瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰無顯著降解或輕微降解，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
	基因組樣本,基本無降解（數據量≥50G）	核酸質量≥1μg以上，濃度≥2ng/μl，體積≥10μl。瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰無顯著降解或輕微降解，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
	FFPE等特殊樣品允許一定程度的降解（數據量＜20G）	核酸質量≥400ng，濃度≥4ng/μl，體積≥10μl。瓊脂糖凝膠電泳條帶在500bp以上。
	FFPE等特殊樣品允許一定程度的降解（數據量≥20G）	核酸質量≥1μg，濃度≥4ng/μl，體積≥10μl。瓊脂糖凝膠電泳條帶在500bp以上。
擴增子測序	小片段直接建庫(NEB)	核酸質量≥50ng以上，濃度≥2ng/μl，體積≥10μl。片段大小100bp-500bp之間，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
擴增子測序	需要打斷(NEB)(片段大小>1000bp)	核酸質量≥500ng以上，濃度≥20ng/μl，體積≥10μl。瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰無顯著彌散，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
插入位點檢測		核酸質量≥400ng以上，濃度大于10 ng/μl，體積大于10 μl。瓊脂糖凝膠電泳DNA條帶清晰無降解或輕微降解，無RNA和蛋白污染，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
簡化擴增子		核酸質量≥150ng以上，濃度≥10ng/μl，片段大小100bp-500bp（含搭橋引物）之間單一條帶。
Ampliseq-CRISPR（on/off target）		核酸質量≥200ng*N以上，N為檢測位點數，濃度≥20ng/μl，體積≥10μl，OD260/2801.8-2.0之間。
gEdit-Screen		質粒：核酸質量≥100ng，濃度≥10ng/μl，瓊脂糖電泳檢測無降解或者輕度降解OD260/2801.8-2.0之間。 DNA：核酸質量≥NX0.07μg，濃度≥200ng/μl，瓊脂糖電泳檢測無降解或者輕度降解OD260/2801.8-2.0之間。 PCR產物：核酸質量≥50ng，濃度≥10ng/μl，條帶單一。
抗體多樣性評估（質粒）		濃度≥10ng/μl，瓊脂糖電泳檢測無降解或者輕度降解OD260/2801.8-2.0之間。
文庫樣品		散樣文庫濃度大于3 nM(qPCR定量濃度)，包Lane文庫濃度大于5 nM(qPCR定量濃度)，體積不低于15μl且樣品中不含有磁珠，文庫兼容相應的測序平臺。其他注意事項： 1)DNA文庫溶解于Illumina Resuspension Buffer(RSB)或其他品牌建庫試劑盒的適當緩沖液中。 2)提供物種信息、片段大小、建庫方式、Agilent 2100 Bioanalyzer質檢圖以及Qubit結果。 3)HiSeq文庫大小介于300bp-500bp之間，MiSeq文庫大小介于300 bp-600 bp之間，無引物二聚體及接頭二聚體)。

RNA樣品

RNA樣品建議在-80℃以下的環境中保存。短時間保存或運輸可以使用干冰或者液氮。長時間運輸，建議將RNA沉淀于75%乙醇中，采用足量干冰或者藍冰運輸（2 kg/day）。

說明：
1．RIN值判定：
1）由于植物會出現多條核糖體RNA條帶，故有時RIN值機器無法判讀或者機器判讀有誤，此時我們會根據Agilent 2100電泳圖來判定樣本是否合格。
2）對于一些特殊物種，如：螞蟻/蟹類等節肢動物、果蠅、魚類等，28S rRNA會被修飾成比較小的片段（一般大小和18S相似），導致28S/18S小于1,因此 RIN值與樣品實際降解情況不符，此類樣本我們會根據Agilent 2100電泳圖來判定樣本是否合格。
3）對于一些經過特殊處理的材料，RIN值與樣本實際降解情況可能不相符合，我們會根據檢測結果的RIN值和降解情況進行判斷。
4）個別樣品Agilent 2100檢測的圖譜與瓊脂糖凝膠電泳圖帶型不一致，可能是樣品中某些成分影響儀器讀數，不能反映樣品真實的帶型。此時我們會根據瓊脂糖電泳圖來判定樣品是否合格。

測序類型	物種類型	樣品要求
polyA篩選建庫（適用于真核生物轉錄組測序）	哺乳動物	1.5 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 6.5，濃度 > 50 ng/μl，體積大于10 μl,5S峰正常。2100峰形正常，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
	昆蟲	1.5 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 5，濃度 > 50 ng/μl，體積大于10 μl,基線平整，5S峰正常。2100峰形正常，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
	植物、真菌、酵母菌、其他動物	1.5 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 6.5，濃度 > 50 ng/μl，體積大于10 μl,5S峰正常。2100峰形正常，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
rRNA去除建庫（適用于真核lncRNA測序及原核生物轉錄組）	真核生物(lncRNA)	2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN >6.5，濃度 > 100 ng/μl，體積大于10 μl,5S峰正常。
rRNA去除建庫（適用于真核lncRNA測序及原核生物轉錄組）	原核生物	2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 6.5，濃度 > 100 ng/μl，體積大于10 μl,5S峰正常。樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
小RNA測序	哺乳動物	2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 7.5，濃度 > 200 ng/μl，體積大于10 μl,5S峰正常。樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
	昆蟲	2 μg以上，260/280 ≥ 2.0，濃度 > 200 ng/μl，體積大于10μl,基線無上抬，5S峰正常。樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
	植物、真菌、酵母菌、其他動物	2 μg以上，260/280 ≥ 2.0， RIN > 7.5，濃度 > 200 ng/μl，體積大于10 μl,5S峰正常。樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
宏轉錄組	由于受樣品來源和雜質含量等影響較大，宏轉錄組樣品建庫比常規轉錄組建庫成功率要低	2 μg以上，濃度≥100ng/μl，體積≥10μl，瓊脂糖凝膠電泳樣本輕中度降解，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
全長轉錄組測序		核酸質量6μg以上，濃度≥280ng/μl，260/280 ≥ 1.8，260/230≥1.8 RIN >8，體積大于10μl,5S峰正常。
全轉錄測序	真核生物轉錄組、表達譜測序， Ribo-zero去除rRNA	核酸質量≥2μg，260/280 ≥ 2.0， RIN值 ≥ 6.5，28S/18S ≥1.0，濃度 ≥ 100 ng/μl，體積≥10μl,5S峰形正常。
	小RNA測序	核酸質量≥2μg，260/280 ≥ 2.0， RIN值 ≥ 7.5，28S/18S ≥1.0，濃度 ≥ 200ng/μl，體積≥10μl,5S峰形正常。樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
免疫訂單	常規起始量建庫	核酸質量≥2μg，260/280 ≥1.9， RIN值 ≥ 7，28S/18S ≥1.0，濃度 ≥ 100ng/μl，體積≥10μl,5S峰形正常。樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
	低起始量建庫	核酸質量≥500ng，260/280 ≥ 2.0， RIN值 ≥ 7.5，28S/18S ≥1.0，濃度 ≥ 50ng/μl，體積≥10μl,5S峰形正常。樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。
免疫組庫及雜交瘤測序		核酸質量≥1ug，濃度 ≥ 100ng/μl，瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰無顯著降解或輕微降解，樣品澄清無色，無粘稠，無不溶解物。

組織樣品

組織樣品根據后續實驗需要，如果需要提取DNA，短時間保存或運輸可以使用冰袋，4℃保存或運輸；長時間運輸建議采用干冰加冰袋的方式。如果需要提取RNA，請使用干冰或液氮運輸，并參考合同中的送樣要求。
特殊樣品或有潛在致病性的樣品，請跟安升達專業團隊溝通確認送樣和運輸要求。
請將樣品名稱標記清楚，將樣品管置于50ml離心管或樣品盒中，再用泡沫塑料或棉花等妥善包裹，保證樣品到達實驗室的時候狀態良好，不破不漏。

DNA

不同類型樣品DNA產量差異較大，請根據樣品實際情況酌情送樣，并保證能夠提取得到對應測序文庫構建所需要的DNA產量。用于DNA相關測序服務的組織樣品，無特殊說明，均采用冰袋運輸。

樣品類型	樣品要求（DNA）
血液	2 ml以上新鮮或者冷凍保存的抗凝血(全血或從全血中提取的白細胞)，推薦使用EDTA抗凝劑，不能用肝素抗凝，以免影響實驗。
離體組織	0.5 g以上動物組織，2g以上植物組織。
細胞	5X10⁶個以上。
細菌樣品	1 g以上菌體沉淀(大約10ml以上對數生長期菌液離心);Pacbio文庫：需要15 g以上菌體沉淀(大約150ml以上對數生長期菌液離心)。
FFPE 樣品	至少10張未經HE染色處理的切片，厚度不小于5微米,切片上組織區域面積應大于等于25平方毫米，其中有核細胞的數量占所有細胞的80%以上，腫瘤細胞組織區域的含量在70%以上。
16S/ITS/18S測序樣品	常規樣品2 g以上沉淀，水樣10 ml以上，根據微生物豐度具體確定。
宏基因組樣品	環境樣本：土壤： 5-10g;糞便：3-5g ;沉積物：5-10g;液體：25mL。水體：選0.22μm或0.45μm的濾膜，過濾，水樣體積5-10mL，最適濾膜面積3-4cm。
其他類型樣品請咨詢安升達項目管理團隊。

葉綠體提取與高通量測序樣品要求

60g以上幼嫩葉片，遮光生長24h，新鮮取樣后冰袋寄送，選擇最快的送樣方式。為了確保實驗室能在收樣當天進行處理，請確保樣品在周一到周四期間到達實驗室。葉綠體DNA文庫構建用量與常規DNA文庫構建用量相同。

RNA

不同類型樣品RNA產量差異較大，請根據樣品實際情況酌情送樣，并保證能夠提取得到對應測序文庫構建所需要的核酸產量。用于RNA相關測序服務的組織樣品，無特殊說明，均采用干冰或液氮運輸。

樣品類型	樣品要求（RNA）
血液	5 ml以上全血收集的淋巴細胞，鳥類或魚類可適當減少送樣量。建議將淋巴細胞用20倍體積TRIzol LS充分裂解?？蛻粢部梢灾苯蛹乃鸵旱賰龅娜獦悠?，建議向新鮮血液中加入3倍體積的TRIzol LS裂解液，干冰寄送，并承擔提取風險。
新鮮組織	動物組織500 mg以上，含肌纖維或脂肪等組織的樣品RNA含量較低，送樣量需增加。植物組織1 g以上，含多糖多酚等的復雜植物組織，請盡可能多的送樣。新鮮組織建議清洗后用錫箔紙包裹或EP管分裝，在3 min內進行液氮速凍。
細胞	5X10⁶個以上。請清洗后離心沉淀，用TRIzol充分裂解并寄送。
細菌樣品	500mg以上新鮮菌體沉淀（大約5ml以上對數生長期菌液離心) ，在3min內進行液氮速凍。菌類樣品不建議保存于TRIzol裂解中送樣。
免疫組庫高通量測序樣品	客戶自行收集血液中的PBMC細胞，細胞總數在1X10⁶-5X10⁶之間，用1ml TRIzol充分裂解，干冰寄送。
其他類型樣品請咨詢安升達項目管理團隊。

高風險樣品

下列高風險樣品請您自行提取RNA，如您堅持送樣，需承擔提取風險和責任，正常收費。

樣品類型	說明
常年保存或反復凍融樣品	RNA質量會受影響，提取風險加大，不建議送樣。
微量組織	動物組織量<20 mg，植物組織量<20 mg，細胞數<10⁵，全血量<2 mL（鳥類），全血量<3 mL（其它動物）等。主要針對珍貴稀缺樣本，鑒于樣品特殊和珍貴程度，此類樣品不接收RNA提取工作，請您自行提取。
困難或特殊樣品	多糖多酚含量異常高的植物老根、成熟米粒、花粉、花蕾、種子、青稞、草莓果實、松樹、藻類、棉花組織、菌類，成分異常復雜的腫瘤組織，牛奶，尿液等。鑒于此類樣品提取方法不成熟，為免來回送樣影響合作伙伴研究進度，請您自行提取。
血漿、尿液等液體	RNA提取風險較大，得率很低。建議使用Trizol LS等處理液體樣品效果好的裂解液進行處理，使用比例（體積比）Trizol LS：液體樣品=3：1。如是全血等雜質較多的樣品，請事先用RNase-Free Water進行1：1稀釋。

寄送信息

寄送要求：
所有樣品必須附帶一份《安升達高通量測序樣品信息單(組織或核酸)》，若是自建庫的文庫測序樣品，需附帶《安升達高通量測序樣品信息單(文庫測序)》；請詳細填寫信息單上所要求的各項樣品信息，包括樣品編號、管數、濃度、體積等，隨同樣品一起寄出，并將電子版發送至 NGS.Service@Azenta.com。

樣品包裝說明：
請將樣品名稱標記清楚，將樣品管置于50ml離心管或樣品盒中，再用泡沫塑料或棉花等妥善包裹，保證樣品到達實驗室的時候狀態良好，不破不漏。

通過快遞直接寄送（順豐）：
如果您所在地點附近沒有樣品箱，或者您的起始材料需要干冰保存，請使用快遞服務，例如順豐快遞。

通過安升達樣品箱（如有）：
在室溫下穩定的起始材料可通過安升達樣品箱（如有）提交。如需詢問您所在地點附近的樣品箱取件服務，或者您對樣品箱有任何疑問，請聯系Public.Sales@Azenta.com。

郵寄地址：

收件人：安升達高通量測序服務
聯系電話：15599039790
收件地址：江蘇省蘇州市蘇州工業園區科教創新區醞慧路8號
郵編：215000

Hiseq 及NovaPE150文庫測序樣本郵寄地址：

收件人：安升達高通量測序服務
聯系電話：18550199367
收件地址：江蘇省南京江北新區浦濱路211號基因大廈二樓215
郵編：211500

如果您有疑問或需要咨詢項目相關事宜，可以隨時聯系安升達的項目管理。請發送郵件至 NGS.Service@Azenta.com或撥打安升達的免費服務電話400-8100-669選項3。安升達期待與您的合作！

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業務咨詢：Enews.China@Azenta.com

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