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      CRISPR-Cas9文庫

      CRISPR-Cas9文庫又稱全基因組CRISPR-Screen,或者高通量基因編輯技術,是一種由Broad研究所的張鋒團隊開發的,基于CRISPR-Cas9系統,通過構建全基因組sgRNA文庫同時對多個細胞的不同基因進行編輯,輔助以特定的篩選方案,通過NGS測序和生信分析的手段,篩選出符合條件的候選基因【1】。
      安升達現在提供Broad研究所授權的現貨供應,針對Human和Mouse全基因組多規格、高質量的CRISPR-Cas9敲除文庫,實現了全基因組功能基因的快速篩選;同時根據客戶的需求,安升達還提供任意物種的sgRNA文庫設計,構建至Broad研究所授權的或客戶自行提供的載體中,文庫質粒構建和質檢的服務;針對可以進行慢病毒包裝的質粒還提供各種規格的慢病毒包裝服務;另外對于動物細胞,安升達還提供sgRNA文庫設計、質粒構建及NGS質檢、慢病毒包裝、Cas9穩定表達細胞系、大規模細胞篩選實驗后NGS測序分析,直至交付客戶最終的分析報告的一站式服務!


      CRISPR-SCREEN篩選詳細流程

      進行CRISPR-SCREEN需要經過多個流程和多個技術平臺,詳細的實驗流程見圖二;

       

      CRISPR-SCREEN全流程總覽

      圖二:CRISPR-SCREEN全流程總覽

      CRISPR-SCREEN對于技術平臺的-1要求

      圖三:CRISPR-SCREEN對于技術平臺的要求[3]

        

      CRISPR-Cas9文庫應用方向

      1. 藥物靶點確定與驗證

      CRISPR-Cas9文庫篩選技術可以應用于藥物靶點篩選中,通過大規模篩選技術,系統的分析、驗證一些與抗藥性相關的基因,從而為疾病治療提供相關的理論基礎。

      2. 基因環路上下游調控機制分析

      CRISPR-Cas9文庫篩選技術不僅可以用于編輯人類細胞蛋白編碼基因,對于基因組中的調控元件也同樣有效,利用這種方法可以對基因環路上下游調控機制進行分析。
       

      3. 代謝通路調節機制分析

      CRISPR-Cas9文庫技術可以應用于動植物的代謝通路條件機制分析。
       

      4. 病毒侵染宿主細胞的受體蛋白篩選:

      通過CRISPR-Cas9文庫技術可以快速的對病毒侵染宿主細胞的受體蛋白進行篩選和鑒定,科學家就曾通過CRISPR-Cas9全基因組文庫篩選技術,成功發現并證實LDLRAD3蛋白是委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)進入動物和人類細胞的受體,以及篩選出冠狀病毒侵入宿主細胞的受體蛋白以及與新冠病毒相關正相關和負相關的重要基因。
       

      安升達產品介紹


      文庫名稱  sgRNA設計信息 
       Human_GeCKOv2_Library_A  數目:63383條sgRNA
       靶向19050個基因,每1個基因包含3條gRNA;
      1864個miRNA,每1個miRNA包含4條gRNA; 
      1000條對照(非靶向性)gRNA。 
       Human_GeCKOv2_Library_B 數目:58028條sgRNA 
      靶向19,050個基因,每3條gRNA靶向1個基因; 
      1000條對照(非靶向性)gRNA。 
       Mouse_GeCKOv2_Library_A 數目:67405條sgRNA 
      靶向20611個基因,每1個基因包含3條gRNA; 
      1175個miRNA,每1個miRNA包含4條gRNA; 
      1000條對照(非靶向性)gRNA。 
       Mouse_GeCKOv2_Library_B 數目:62804條sgRNA 
       靶向20611個基因,每1個基因包含3條gRNA;
      1000條對照(非靶向性)gRNA。 

      現貨質量標準

          

      現貨質量標準_1

      覆蓋度:NGS測序分析sgRNA數量與預期sgRNA數量的比值,越接近100%,說明文庫質量越好。

      均一性:均一性根據各樣本 sgRNA 數目,統計其分布斜率,并進行可視化展示,如上圖所示。累積分布達到90%時對應的 sgRNA 數目與累積分布達到10%時對應的 sgRNA 數目的比值即為文庫的均一性,一般認為,均一性 < 10,則文庫均一性合格,越接近1文庫均一性越好。

      注:均一性對實驗的影響:均一性越低,不同sgRNA之間越平均,出現低頻sgRNA數目越少,在后續實驗過程中由于sgRNA文庫質量而丟失的可能性越低,最終分析結果則越接近真實情況。

      安升達現貨文庫質檢信息

      覆蓋度:≥99.99%
      NGS測序深度:≥300x
      均一性:2.5-3.0

      安升達定制化CRISPR-Cas9文庫服務介紹及優勢介紹

      SgRNA文庫設計優勢

      可設計任意NCBI數據庫中存在的物種或基因的sgRNA
      可定制特定物種全基因組文庫和亞文庫
      可一次設計上萬條sgRNAs
      特異性強

      sgRNA文庫構建及質檢的優勢:

       · 可提供Broad研究所專利授權的CRISPR-Cas9文庫載體(LentiCRISPR v2和LentiGuide-Puro),也可以克隆至客戶指定的載體中。

       · 具有豐富的文庫構建技術經驗和成熟的NGS測序平臺,確保文庫質量。

       · 交付的產品為高達500 μg或更高規格的無內毒素質粒,可直接用于病毒包裝或下游應用。

       · Oligo pool的長度最長可達300 nt;滿足更多的客戶需求。

       · 可以提供1.0E+09TU~1.0E+10TU規格的慢病毒包裝服務,滿足客戶對大量病毒的需求。

      安升達定制化sgRNA文庫質量標準

      覆蓋度:≥99%
      質??偭浚骸?00 μg(無內毒素)
      均一性:<8
      NGS測序深度:≥300x

      案例分析

       

      文庫編號  文庫1  文庫2  文庫3 
       平均測序深度  1015  420  444
       均一性  2.36  2.64  2.57
       覆蓋度  100%  100%  99.97%

       

      案例說明:我們統計了三個不同sgRNA庫容量大小的的質量標準分析,分別代表了亞文庫,全基因組文庫和超大文庫三種不同應用場景的文庫;通過NGS測序分析,結果表明:安升達構建的文庫質量,覆蓋度和均一性都具有較高的標準。

       

      CRISPR-Cas9文庫應用技巧分享

      為了讓更多的研究者了解和應用CRISPR-Cas9文庫技術,并利用這項技術進行更多的研究,安升達對CRISPR-Cas9文庫技術的應用中可能遇到的問題,根據本公司多年的項目經驗,進行了深度解析,幫助有興趣的客戶了解這項技術。

      鏈接:https://mp.weixin.qq.com/s/VRrrVLlVJDKYsdaJyN75pQ

       

      參考文獻:
      [1] Konermann, Silvana, et al. "Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex." Nature 517.7536 (2015): 583-588.
      [2] Wei, Jin, et al. "Genome-wide CRISPR screens reveal host factors critical for SARS-CoV-2 infection." Cell (2020).
      [3]Feng Zhang et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science  (2014)
      [4] Hartenian E, Doench J G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology[J]. Febs Journal, 2015, 282(8):1383-1393.
      [5] Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7
      [6] Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.
      [7] Li, R., et al., Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum. Plant Biotechnol J, 2017
      [8] Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286.
      [9] Ma, Hongming, et al. "LDLRAD3 is a receptor for Venezuelan equine encephalitis virus." Nature (2020): 1-7.

       

       

      安升達提供的CRISPR/Cas9技術服務的授權來自Broad研究所。

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