CRISPR-Cas9轉錄激活文庫

CRISPR-Cas9系統是目前最高效，精準，簡單易操作的基因編輯系統。最近，CRISPR-Cas9也被應用于基因組水平的功能獲得型（gain-of-function，GOF）遺傳篩選，即CRISPRa (CRISPR activation)。其基本原理是：通過融合催化活性失活的效應蛋白Cas9（dCas9）和轉錄激活調控元件如VP64 或 p65的轉錄激活域，在sgRNA的引導下，靶向目標基因啟動子區，激活目標基因的轉錄^【1】。

GOF文庫篩選特點以及CRISPR-Cas9 轉錄激活文庫篩選的優勢：首先，一些功能冗余基因，它們的單突變體表型不強，很難通過功能缺失型遺傳篩選（Loss-of-function，LOF）篩選得到；在研究一些缺失致死基因的其他表型時，LOF也并不適用，這些情況下使用GOF篩選可能有更好的效果^【2】。另外，傳統的GOF通過強啟動子驅動cDNA表達，構建的cDNA過表達文庫代表性不完全。泛表達的強啟動子會造成基因的異位表達，常常超出自身基因表達生理水平極限，無法實現內源性調控下的過表達和對不同轉錄本過表達多樣性的調控，且構建成本高昂?；贑RISPR-Cas9的轉錄激活文庫克服了上述缺陷，它可以原位的激活內源性基因座的基因轉錄（包括編碼基因，非編碼基因，基因的不同轉錄本和過長的轉錄本），并且只需要合成和克隆RNA向導即可，更加經濟實惠^【1】。
安升達公司提供Broad授權的CRISPR-Cas9 synergistic activation mediator (SAM) 系統^【3】。研究發現，在不同的細胞系和物種中對比其他CRISPRa系統如SunTag（通過表位的重復肽陣列與單鏈可變片段抗體配對來募集多個VP64激活域）和VPR（dCas9融合三種轉錄激活域即VP64-p65-Rta），SAM在某些情況下可誘導更有效的激活^【4】。
SAM系統包含三部分組件：
1，細胞核定位的催化活性缺失dCas9與VP64激活域的融合蛋白，NLS-dCas9-VP64。
2，修改的sgRNA骨架，在四環區（tetraloop）和莖環2區（stem loop 2）加入兩個發卡結構適配子（hairpin aptamer），可以結合二聚化的MS2噬菌體外殼蛋白。
3，MS2與p65和人類熱激轉錄因子HSF1轉錄激活域的融合蛋白，MS2-p65-HSF1。
如圖1所示，sgRNA與dCas9組裝成復合體，發卡結構結合MS2蛋白，最終將VP64，p65和HSF1轉錄激活域招募到基因組的特定位置如啟動子序列，轉錄起始位點（Transcription start site, TSS）附近，提高目標基因的轉錄水平。

CRISPR-Cas9 SAM篩選詳細流程

CRISPR-Cas9 SAM系統有三部分，因此需要先構建穩定表達SAM系統的細胞系。以MOI<1將NLS-dCas9-VP64 和MS2-p65-HSF1慢病毒轉染目標細胞（此步驟也可以將sgRNA表達框與dCas9-VP64構建在同一個載體骨架中，則只需先構建穩定表達MS2-p65-HSF1的細胞系），進行抗生素篩選，篩選完成后得到穩定表達dCas9-VP64 和MS2-p65-HSF1的細胞系，以MOI≈0.3將SAM sgRNA慢病毒文庫轉染上述篩選完成的細胞，抗生素篩選后，達到約每個sgRNA有500個細胞覆蓋；根據實驗目的進行小分子，藥物或其他條件處理后，分離DNA，擴增DNA，NGS建庫測序，數據分析（圖2）。

CRISPR-Cas9 SAM文庫篩選流程

圖2 CRISPR-Cas9 SAM文庫篩選流程示意圖^【1】

注意事項：包裝完成的sgRNA慢病毒文庫以比較低的MOI如0.3轉染目標細胞，經過抗生素篩選，盡量使每個細胞僅接受一個拷貝的sgRNA，即每個細胞僅有一個目標基因被過表達；轉染細胞的數量建議每條sgRNA>500個細胞。

CRISPR-Cas9轉錄激活文庫應用案例

1. 藥物作用機制的研究：Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex
在頑固的疾病治療中，常常有病人對治療藥物產生先天或后天的抗藥性。因此，在基因組水平理解哪些基因會影響藥物的功效能夠為臨床治療提供更準確的方案。Konermann等^【3】應用SAM轉錄激活文庫在A375（BRAF(V600E)）黑色素瘤細胞中篩選抵抗黑色素瘤藥物（BRAF inhibitor，PLX-4720）的基因位點。該研究構建了基因組水平的SAM sgRNA慢病毒文庫，包含70290個sgRNAs，靶定RefSeq數據庫中23430個coding isoforms轉錄起始位點上游200 bp位置，每個基因設計3個sgRNAs。通過文庫篩選，NGS分析和驗證，最終鑒定到一系列已知的和新的參與PLX-4720抗藥性相關的候選基因（圖3）。

SAM轉錄激活系統篩選流程

圖3 SAM轉錄激活系統篩選流程圖^【3】

2. 長鏈非編碼RNA功能研究：Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighborhood

哺乳動物基因組包含成千上萬個可以轉錄長的非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNA）的基因座，其中一些已知在多種細胞過程中起關鍵調控作用。盡管lncRNAs可能以反式（in trans, act non-locally）的方式起作用，但也有證據表明，許多lncRNAs以順勢（in cis, act locally）的方式參與調控，即該基因座的lncRNA會對附近基因的表達起調控作用。然而，直到目前，對lncRNA功能和機制的研究仍充滿挑戰。為了探索該問題，Joung等^【5】構建了基因組水平上靶定10000多個lncRNA轉錄起始位點的sgRNA慢病毒文庫，并利用SAM轉錄激活系統在黑色素瘤細胞中篩選鑒定到11個新的介導BRAF抑制劑（vemurafenib）抗性的lncRNA基因座。對其中一個候選基因：EMICERI 進行詳細功能分析發現，該lncRNA的轉錄激活導致四個相鄰蛋白質編碼基因的劑量依賴性激活，并且其中一個蛋白編碼基因導致了BRAF抑制劑抗性表型。該研究為系統的探索非編碼RNA的功能提供了參考。

SAM轉錄激活系統鑒定參與抗vemurafenib的lncRNAs

圖4 SAM轉錄激活系統鑒定參與抗vemurafenib的lncRNAs^【5】

安升達CRISPRa產品介紹

安升達提供定制化CRISPR-Cas9 SAM轉錄激活文庫服務，包括轉錄激活sgRNA的設計，質粒構建及NGS質檢、慢病毒包裝、SAM系統穩定表達細胞系、細胞篩選實驗后NGS測序分析，交付客戶分析報告，為客戶提供一站式服務。

sgRNA文庫構建及質檢的優勢：

可提供Broad專利授權的CRISPR-Cas9 SAM系統載體（lentiMPH v2，lentiSAMv2， lentiSAMv2-Puro和lenti sgRNA(MS2) puro optimized backbone），也可以將sgRNA克隆至客戶指定的載體中。

交付的產品為高達500 μg或更高規格的無內毒素質粒，可直接用于病毒包裝或下游應用。

可以提供1.0E+09TU~1.0E+10TU規格的慢病毒包裝服務，滿足客戶對大量病毒的需求。

具有豐富的文庫構建經驗和成熟的NGS測序平臺，確保文庫質量。

Oligo pool的長度最長可達300 nt

安升達定制化sgRNA文庫質量標準

覆蓋度：≥99%

質?？偭浚骸?00 μg（無內毒素）

均一性：＜8

NGS測序深度：≥300x

項目經驗

文庫編號	文庫1	文庫2	文庫3
平均測序深度	1015	420	444
均一性	2.36	2.64	2.57
sgRNA 文庫容量	4997	86490	281888
覆蓋度	100%	100%	99.97%

案例說明：我們統計了三個不同sgRNA庫容量大小的的質量標準分析，分別代表了亞文庫，全基因組文庫和超大文庫三種不同應用場景的文庫； NGS測序分析結果表明：安升達構建的不同標準的文庫，其文庫質量，覆蓋度和均一性都達到了較高標準。

文獻引用：
[1] Joung, Julia, et al. "Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening." Nature protocols 12.4 (2017): 828-863.
[2] Cruz, Cristina, et al. "A gain-of-function screen identifying genes required for growth and pattern formation of the Drosophila melanogaster wing." Genetics 183.3 (2009): 1005-1026.
[3] Konermann, Silvana, et al. "Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex." Nature 517.7536 (2015): 583-588.
[4] Chavez, Alejandro, et al. "Comparison of Cas9 activators in multiple species." Nature methods 13.7 (2016): 563-567.
[5] Joung, Julia, et al. "Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood." Nature 548.7667 (2017): 343-346.

安升達提供的CRISPR/Cas9技術服務的授權來自Broad研究所。

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