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基因敲入
基因敲入（gene knock in）是一種將外源功能基因，整合或替換到基因組特定位點，并在細胞內獲得穩定表達的技術。它在基因功能、疾病模型、藥物篩選等研究領域有著廣泛的應用。然而，基于基因敲入依賴于同源重組（Homologous Recombination）的特點，一定程度上決定了其低概率性，即效率低下始終是基因編輯領域的一大瓶頸，即便結合第三代基因編輯系統CRISPR/CAS9這一強大技術，精確定點敲入的仍然常常難以高效的實現。CRISPR/CAS9介導基因敲入的原理是通過斷裂DNA雙鏈，導致細胞內激活DNA修復機制，主要是非同源重組型末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重組型修復（homology-directed repair，HDR），其中非同源末端連接引發的隨機突變，目前已經發展成為基因敲除的主要方法，同源重組修復雖然在自然情況下發生概率很低，但是在外源DNA模板存在的條件下，能夠提高同源重組效率（圖1），進而介導外源基因的精確敲入?；蚯萌胄什粌H取決于同源重組的低概率性，還取決于敲入位點、敲入片段大小、細胞系的選擇、是否含有篩選標記等眾多潛在條件的限制。下面介紹3中常見的基因敲入類型：Tag標簽敲入（無痕敲入）、報告基因敲入、基于puro標記篩選的safe harbor位點基因敲入（標記篩選）。
服務標準
| 客戶需提供 | 安升達交付 | 交付周期 | |
| 標準服務 | 基因序列和NCBI ID 宿主細胞 細胞株培養條件 |
基因敲入單克細胞一株 細胞cofA文件 測序結果 |
12-16周 |
| 附加服務 | - | 額外單克隆交付 | - |
| Western blot/FACS抗體 | 敲入細胞株蛋白水平驗證結果 | 1-2周 | |
| - | 敲入細胞株mRNA水平驗證 | 1-2周 |
*注：一般由客戶提供宿主細胞系，如果需要由安升達提供宿主細胞系，需要額外收費。
*如果宿主細胞使用的是常規培養基，如：RPM1640、DMEM、MEM等無需客戶提供，如果是特殊培養基及添加物，需要客戶提供。
*如果宿主細胞使用的是常規培養基，如：RPM1640、DMEM、MEM等無需客戶提供，如果是特殊培養基及添加物，需要客戶提供。
基因敲入細胞系構建流程：
案例分析1：Tag標簽敲入-An efficient and scalable pipeline for epitope tagging in mammalian stem cells using Cas9 ribonucleoprotein.
V5 標簽是從猿猴病毒5（simian virus 5，SV5）P和V蛋白中分離得到的由14個氨基酸殘基（GKPIPNPLLGLDST）組成的序列，常被用于跨膜型蛋白和分泌型蛋白的N 末端或者 C 末端進行融合表達，以便對靶蛋白進行分析和鑒定。本案例中在兩種來源小鼠神經干細胞目的基因C末端進行V5標簽敲入[2]，設計左右同源臂79bp左右，在無篩選標記的情況下，分別實現13.9%和17.6%的高效率基因敲入。
圖2 Crispr/cas9介導V5標簽敲入[2]
案例分析2：報告基因敲入（無痕敲入）-CRISPR/Cas9-Mediated Gene Tagging: A Step-by-Step Protocol.
報告基因(reportgene)是指一類編碼易被檢測的蛋白質或酶的基因，常見的報告基因包括熒光類報告基因（GFP和RFP）和熒光素酶類報告基因。報告基因的編碼序列和基因表達調節序列融合，或與其他目的基因融合，在調控序列的控制下進行表達，通過檢測報告基因的表達產物來標記目的基因的表達調控以及跟蹤目的基因。本案例是一篇典型的報告基因敲入方法[3]，通過在目的基因C短終止密碼子附近設計sgRNA，并依據Cas9切割位點設計左右同源臂，經過藥物篩選后（此藥物標記存在于打靶載體，僅用于轉染標記），陽性pool擴大培養，并通過熒光顯微鏡觀察copGFP表達，挑選熒光陽性細胞進行單克隆培養以及后續驗證，成功獲取copGFP基因敲入細胞系。
圖3 報告基因敲入示意圖[3]
案例分析3：基于puro標記篩選的safe harbor位點基因敲入-A high-throughput small molecule screen identifies farrerol as a potentiator of CRISPR/Cas9-mediated genome editing.
Safe harbor 位點是一種經過公認的對細胞或活體影響較小且敲入目的基因后能穩定表達的位點，目前常用的安全位點為AAVS1（人源）和Rosa26（鼠源），但由于基因敲入安全位點是一個低概率事件，為便于陽性細胞克隆篩選，常規的做法是在敲入表達框內加入藥物篩選標記，通過2A肽或其他linker連接進行非融合或融合表達，常見的藥物篩選標記有Puro, Neo，BSD等。本案例中，通過CRISPR/Cas9系統介導非融合Puro和GFP敲入[4]，Puro作用是去除大量無抗性的陰性細胞，通過puro篩選，可以確定外源基因敲入，并結合GFP熒光，可以確定puro和GFP功能序列正確敲入。理論上GFP本身就是一個篩選標記，但是由于敲入的低概率性，單純的熒光篩選操作困難，引入puro篩選可以去除大量陰性細胞，簡化后續單克隆篩選流程。
圖4 基于puro標記篩選的safe harbor位點基因敲入[4]
總而言之，基因敲入相對來說是一個低概率事件，但隨著CRISPR/CAS9系統的出現，使基因敲入效率有了明顯的提高，并基于CRISPR/CAS9系統發展了包括同源重組（HR）、單鏈退火（SSA）、非同源末端連接（NHEJ）、微同源性介導的末端連接（MMEJ）或同源性介導的末端連接（HMEJ）等技術，綜合這些實驗方案，我們解決基因敲入難題有了更多選擇，如何根據自身實驗課題選擇最理想的方案，往往對實驗成敗起著決定性作用。安升達憑借強大的技術團隊，針對您的需求，綜合評估并選取最理想的技術策略，確保及時、高效的為您解決科研上的后顧之憂。
參考文獻
[1] Anzalone A V, Randolph P B, Davis J R, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA[J]. Nature, 2019, 576(7785): 149-157.
[2] Dewari P S, Southgate B, Mccarten K, et al. An efficient and scalable pipeline for epitope tagging in mammalian stem cells using Cas9 ribonucleoprotein[J]. Elife, 2018, 7:e35069.
[3] Xiang X, Li C, Chen X, et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol[M]//CRISPR Gene Editing. Humana Press, New York, NY, 2019: 255-269.
[4] Zhang W, Chen Y, Yang J, et al. A high-throughput small molecule screen identifies farrerol as a potentiator of CRISPR/Cas9-mediated genome editing[J]. Elife, 2020, 9:e56008.
安升達提供的CRISPR/Cas9技術服務的授權來自Broad研究所。
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