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DNA克隆定點突變
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基因片段敲除
CRISPR-Cas9系統介導的基因敲除目前已廣泛應用于基因組功能水平研究，常見的基因敲除策略有兩種，一種是單個sgRNA介導的基因敲除，通過CRISPR-Cas9系統在編碼基因外顯子產生的InDels造成基因移碼突變，進而達到基因敲除的目的，因此，此種基因敲除策略僅限于編碼基因的敲除；另一種是兩條sgRNA介導的基因敲除，通過兩條sgRNA作用于目的片段兩側，實現目的片段序列刪除，進而實現目的基因的敲除，此種基因敲除策略不僅適用于編碼基因，同樣適用于非編碼功能元件和ncRNA基因，這些非編碼DNA序列無法通過移碼突變方式達到功能失活的目的，必須依賴于功能片段的缺失（圖1）。因此，通過片段刪除的方式實現基因的敲除，也是一種應用廣泛的基因敲除策略。
服務標準
| 客戶需提供 | 安升達交付 | 交付周期 | |
| 標準服務 | 基因序列和NCBI ID 宿主細胞 細胞株培養條件 |
基因敲除（片段刪除）單克細胞一株 細胞cofA文件 測序結果 |
10-12周 |
| 附加服務 | - | 額外單克隆交付 | - |
| Western blot/FACS抗體 | 敲除細胞株蛋白水平驗證結果 | 1-2周 | |
| - | 敲除細胞株mRNA水平驗證 | 1-2周 |
*注：一般由客戶提供宿主細胞系，如果需要由安升達提供宿主細胞系，需要額外收費。
*如果宿主細胞使用的是常規培養基，如：RPM1640、DMEM、MEM等無需客戶提供，如果是特殊培養基及添加物，需要客戶提供。
*如果宿主細胞使用的是常規培養基，如：RPM1640、DMEM、MEM等無需客戶提供，如果是特殊培養基及添加物，需要客戶提供。
基因片段刪除細胞系構建流程：
案例分析1：編碼基因片段刪除-The stability and oncogenic function of LIN28A are regulated by USP28.
編碼基因的敲除有兩種常見策略，一種為Crispr/Cas9作用于外顯子產生InDels導致移碼突變，另一種方法是對編碼基因外顯子片段刪除。本案例中USP28基因為編碼基因，一種去泛素化酶，通過與LIN28A蛋白相互作用并穩定其半衰期。USP28通過其去泛素化活性，逆轉蛋白酶體降解作用，可拮抗LIN28A蛋白降解。通過在外顯子2中設計兩條sgRNA進行外顯子2片段刪除，實現對USP28基因功能的敲除，并驗證了敲除后NCCIT細胞中LIN28A蛋白量降低[1]。
圖2USP28基因片段刪除[1]
案例分析2：非編碼基因（LncRNA）片段刪除-Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Versatile, Predictable, and Donor-Free Gene Knockout in Human Pluripotent Stem Cells
長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA。研究表明, lncRNA 在劑量補償效應、表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發揮重要作用，成為遺傳學研究熱點。本案例中MALAT1基因即為lncRNA基因，僅包含一個外顯子，案例從方法學角度在iPSC細胞中對lncRNA基因進行敲除，通過不同sgRNA組合對MALAT1基因外顯子片段進行刪除，刪除序列大小分別為500bp,1000bp,3000bp, 8000bp. 刪除效率見下圖表格，純合刪除效率隨著刪除片段越大整體上呈下降趨勢[2]。因此，對較大的lncRNA，刪除外顯子的大小要根據基因的序列特征選擇合適的刪除片段，才能較大概率獲取純合基因刪除單克隆細胞系。
圖3 MALAT1基因片段刪除[2]
案例分析3：長片段基因刪除(>10kb)-Efficient in vivo deletion of a large imprinted lncRNA by CRISPR/Cas9.
基因長片段的刪除通常應用于lncRNA基因刪除, 且大多應用活體水平的操作。本案例介紹在活體水平刪除Rian基因，此基因大小為57.8kb,包含21個外顯子，案例中設計刪除了包含23kb范圍內的14個外顯子, 實驗結果統計表明，25個小鼠中含有4個顯示Rian基因刪除[3]，但是均為雜合敲除。對于片段刪除，總的趨勢是隨著片段越大，刪除效率越低，大片段刪除效率范圍為總體約1%至13%[4] [5]， 可能的原因可能受基因染色體背景影響、DNA修復機制影響。此外，獲取純合刪除拷貝困難因素還受基因拷貝數多少等影響。
圖4 Rian基因片段刪除[3]
總而言之，相比通過CRISPR/Cas9產生InDels而介導基因敲除，通過兩條sgRNA介導DNA片段刪除具有更廣泛更可靠的特點，具體表現在（1）可以對非編碼基因進行敲除；（2）可以在基因組水平上對DNA片段進行刪除；這些都決定了CRISPR/Cas9系統介導的片段刪除具有更廣泛、更可靠的特點，必將作為基因功能研究的優先選擇之一。
參考文獻:
[1] Haq S, Das S, Kim D H, et al. The stability and oncogenic function of LIN28A are regulated by USP28[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, 2019, 1865(3): 599-610.
[2] Liu Z, Hui Y, Shi L, et al. Efficient CRISPR/Cas9-mediated versatile, predictable, and donor-free gene knockout in human pluripotent stem cells[J]. Stem cell reports, 2016, 7(3): 496-507.
[3] Han J, Zhang J, Chen L, et al. Efficient in vivo deletion of a large imprinted lncRNA by CRISPR/Cas9[J]. RNA biology, 2014, 11(7): 829-835..
[4] He Z, Proudfoot C, Mileham A J, et al. Highly efficient targeted chromosome deletions using CRISPR/Cas9[J]. Biotechnology and bioengineering, 2015, 112(5): 1060-1064.
[5] Kraft K, Geuer S, Will A J, et al. Deletions, inversions, duplications: engineering of structural variants using CRISPR/Cas in mice[J]. Cell reports, 2015, 10(5): 833-839.
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