<acronym id="9t7gy"></acronym>

<acronym id="9t7gy"></acronym>





      基因敲除:移碼突變

      CRISPR/Cas是一種原核生物的自適應免疫系統,抵御來自噬菌體或外源質粒的入侵。這個原核生物系統的已廣泛被分子生物學所采用,目前已成為基因組工程最強大和最通用的平臺之一。 CRISPR/Cas9是一種簡單而快速的工具,不僅可對各種物種(動物、植物、微生物等)中的內源基因進行有效修飾(敲除、敲入、定點突變),對其進行優化還可實現強大的轉錄抑制或靶基因的激活。CRISPR/Cas9的簡便性使其在許多領域廣泛應用,包括基礎研究,生物技術和生物醫學[1,2,3]。
      CRISPR/Cas9編輯系統是在sgRNA(約20nt,與靶基因序列互補)的引導下,Cas9特異性切割目標基因,造成DNA雙鏈的斷裂(double-strand DNA breaks,DSBs),從而引起生物體內的DNA損傷修復。這種修復作用主要包括兩種途徑,一種是利用非同源重組(NHEJ)的修復,即易錯修復,可能造成基因組的隨機插入或缺失突變,這種方式常導致靶基因失去功能,基因敲除就是利用該修復機制[1,2]。另一種是利用同源重組修復(HDR),即精準修復,借助外源引入一段與預期編輯位點上下游緊鄰且高度同源的DNA修復模板(donor,可以是短單鏈DNA序列(ssDNA)或質粒)介導序列的替換或插入,基因敲入和定點突變就是利用該修復機制[3]。



      服務標準

         客戶需提供 安升達交付  交付周期 
       標準服務 基因序列和NCBI ID
      宿主細胞
      細胞株培養條件
      基因敲除單克細胞一株(純合/雜合)
      細胞cofA文件
      測序結果
       8-10周
      基因序列和NCBI ID
      宿主細胞
      細胞株培養條件 
       基因敲除陽性pool
      細胞cofA文件
      測序結果
        4-6周
       附加服務  -  額外單克隆交付  -
       Western blot/FACS抗體  敲除細胞株蛋白水平驗證結果  1-2周
       -  敲除細胞株mRNA水平驗證  1-2周

       

       
      *注:一般由客戶提供宿主細胞系,如果需要由安升達提供宿主細胞系,需要額外收費。
      *如果宿主細胞使用的是常規培養基,如:RPM1640、DMEM、MEM等無需客戶提供,如果是特殊培養基及添加物,需要客戶提供。

       

      敲除細胞系構建流程:

      敲除細胞系構建流程

       
      案例分析1:CRISPR-Cas9 Mediated NOX4 Knockout Inhibits Cell Proliferation and Invasion in HeLa Cells.
       
      活性氧(ROS)參與了多種作為細胞內信號分子的生物過程。NADPH氧化酶負責產生活性氧,NADPH氧化酶4(NOX4)是NOX/DUOX家族的成員,其中包括7種亞型(NOX1-5和DUOX 1-2),而NOX4是最豐富的亞型之一并廣泛表達NOX異構體。 NOX4負責生產H2O2,NOX4在腎臟中的表達特別高。因此很多研究集中于NOX4在腎臟生理和病理生理中的作用[4]。作者利用CRISPR技術對Hela細胞中的NOX4基因進行敲除[4]。

      20210226-1

      圖1. [4]
        
      針對NOX4的3號外顯子設計2條sgRNA序列,如下,gRNA #1:5’-CACCGGCACATGGGTAAAAGGATG-3’;gRNA #2 :5’-AAACTA TCCTTTTACCCATGTGCC-3’。sgRNA構建至 pX459 CRISPR/Cas9-Puro vector (Addgene, Cambridge, MA)。Hela細胞轉染后的的PCR產物進行T7E1分析,使用Puro篩選陽性細胞,并分單克隆。測序結果和WB結果表明#1-2、#1-5、#1-6這三個克隆的NOX4基因均已成功敲除[4]。

      參考文獻:
      [1] Nelly M. Cruz and Benjamin S. Freedman. CRISPR Gene Editing in the Kidney. Author manuscript, Am J Kidney Dis . 2018;71(6): 874–883.
      [2] Hryhorowicz M, Lipinski D, Zeyland J, et al. CRISPR/Cas9 immune system as a tool for genome engineering. Arch Immunol.2017;65(3):233–240.
      [3] Savi´c, N.; Schwank, G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Transl. Res.2016; 168,15–21.
      [4] Jafari N, Kim H, Park R, Li L, Jang M, Morris AJ et al. CRISPR-Cas9 mediated NOX4 knockout inhibits cell proliferation and invasion in HeLa cells. PLoS One.2017;12:e0170327.

       

       

      安升達提供的CRISPR/Cas9技術服務的授權來自Broad研究所。

      售 前 咨 詢
      售前客服

       

      gogoanime
      亚洲 欧美 卡通 另类 小说_日韩视频特黄色大片_亚洲 欧洲 日产 韩国_亚洲欧美性交图片
      <acronym id="9t7gy"></acronym>

      <acronym id="9t7gy"></acronym>