技術細節

GENEWIZ開發了一套針對rAAV質粒構建、錯誤ITR的修復和rAAV質粒大量制備的方法——Hi-Fi技術，該方法的核心點不僅僅是制定了更簡單、靈活和快速的克隆方案，而更重要的是發明了一種特殊的大腸桿菌細胞及其配套使用的AAV穩定劑，較現有的方法更能使rAAV質粒的ITR在細菌中擴增過程中保持穩定，不易再發生缺失（表1）。

 表1：5個隨機AAV構建后ITR的正確性

基于感受態細胞的對比數據，安升達進一步探索了Hi-Fi技術流程在轉化篩選正確克隆過程中的能力。由于ITR本身的不穩定性，在質粒構建的過程中，會有發生突變的可能性。

原始質粒：

第一次轉化結果：

 

目前安升達基于Hi-Fi技術可以提供rAAV的質粒構建，ITR區域的修復和rAAV質粒大量制備以及AAV病毒包裝等相關服務。

 

 

技術流程

 

案例分享

1、項目類型：Hi-Fi 技術構建 rAAV 載體

目的基因以及ITR區域合成之后，構建AAV載體之后，再利用SmaI酶進行酶切后，驗證條帶大小。

圖5: 酶切圖，L1: undigested；L2: digested with SmaI and BsrGI；L3: ladder 5000

條帶大小正確后，再利用sanger測序技術，測定目的基因和ITR區域序列：

圖6：ITR區域測序圖

上圖可以看出，Sanger測序驗證了rAAV左右兩側的ITR區域序列正確。從而確保rAAV載體構建正確。

 

2.、項目類型：Hi-Fi技術修復ITR序列

AAV原始質粒ITR缺失突變，常規PCR擴增很難直接完成序列修復，安升達通過特定修復方案及Hi-Fi技術流程，成功交付多例修復質粒。