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      ITR測序

      腺相關病毒基因組(adeno-associated virus, AAV)的反向末端重復序列(inverted terminal repeat, ITR)能形成高度穩定的二級結構,利用現有技術很難進行序列驗證。為了突破這重障礙,GENEWIZ研制了一種新型專利技術,運用前所未有的測序方法,清晰地分析這些復雜序列,助力研發人員有效地評估ITR區域的完整性。
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      20200521-1

      圖1. AAV2的ITR序列的示意圖。ITR由兩個回文臂(B-B'和C-C')和一個長莖回文(A-A')組成。D序列在AAV基因組的每一端只出現一次。

       

      腺相關病毒(AAV)是一種單鏈DNA病毒,在基因治療中通常作為載體將外源基因轉入患者中。AAV基因組的每條單鏈DNA包括兩端的反向末端重復序列(ITR)和中間的2個開放性閱讀框。ITR在病毒的復制和包裝過程中起著關鍵作用,并且參與了病毒基因組在宿主基因組上的整合和逃逸過程。該序列中CG含量達80%以上,其前125bp(1~125)序列依次可分為A、B、B’、C’、C、A’等不同的區段(圖1),其中B與B’、C與C’反向互補,可形成T型發夾結構,作為AAV的DNA自我復制的起點,隨后的20bp形成特有的D序列。


      GENEWIZ開發了一種新型的ITR測序方法,可以改善ITR區域的測序信號并延長讀取長度。

      測序服務類型

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        圖2. 使用T公司的測序試劑盒對AAV2的ITR區域進行測序

        紅色下劃線標記序列后的堿基“CCTGC”是一個無法成功測序的發夾結構的開端。

      •  

        圖3. 使用安升達 AAV-ITR測序法測定AAV2的ITR區域的色譜圖

        紅色下劃線的序列表示圖2中提到的相同序列。紅框內顯示完整的發夾結構。

      ITR測序服務優勢

      有效

      AAV-ITR測序方法能有效評估AAV質粒中ITR區域的完整性,迅速準確地檢測到ITR區域的突變,為下游故障的排除節省時間和精力。

      支持

      安升達的技術支持會無償地與您探討項目進展,解決技術難題。咨詢時間為每個工作日上午8點30至下午9點。周末正常發送結果,以供您周末使用。

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      送樣要求

      樣品類型:質粒

      送樣體積:體積≥10ul,每增加一個反應,送樣體積增加5ul

      引物要求:遵循引物設計規范,且設計的引物位置距離ITR區域150-350bp

      樣品濃度:濃度在200ng/ul-400ng/ul之間(最低不能低于150ng/ul,濃度過高需稀釋)

       樣品介質:使用雙蒸水溶解

      其他要求:送樣時需注明濃度和質粒大小,外包裝需明顯標注“ITR測序”字樣

      下載 Azenta安升達ITR測序送樣單 按要求填寫并發送至郵箱:Support.Asia@Azenta.com

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