圖1. AAV2的ITR序列的示意圖。ITR由兩個回文臂(B-B'和C-C')和一個長莖回文(A-A')組成。D序列在AAV基因組的每一端只出現一次。
腺相關病毒(AAV)是一種單鏈DNA病毒,在基因治療中通常作為載體將外源基因轉入患者中。AAV基因組的每條單鏈DNA包括兩端的反向末端重復序列(ITR)和中間的2個開放性閱讀框。ITR在病毒的復制和包裝過程中起著關鍵作用,并且參與了病毒基因組在宿主基因組上的整合和逃逸過程。該序列中CG含量達80%以上,其前125bp(1~125)序列依次可分為A、B、B’、C’、C、A’等不同的區段(圖1),其中B與B’、C與C’反向互補,可形成T型發夾結構,作為AAV的DNA自我復制的起點,隨后的20bp形成特有的D序列。
GENEWIZ開發了一種新型的ITR測序方法,可以改善ITR區域的測序信號并延長讀取長度。
圖2. 使用T公司的測序試劑盒對AAV2的ITR區域進行測序
紅色下劃線標記序列后的堿基“CCTGC”是一個無法成功測序的發夾結構的開端。
圖3. 使用安升達 AAV-ITR測序法測定AAV2的ITR區域的色譜圖
紅色下劃線的序列表示圖2中提到的相同序列。紅框內顯示完整的發夾結構。
送樣體積:體積≥10ul,每增加一個反應,送樣體積增加5ul
引物要求:遵循引物設計規范,且設計的引物位置距離ITR區域150-350bp
樣品介質:使用雙蒸水溶解
其他要求:送樣時需注明濃度和質粒大小,外包裝需明顯標注“ITR測序”字樣